PA基因影响流感病毒哺乳动物适应性和致病性的机制

发布时间：2017-12-09 17:26

  本文关键词：PA基因影响流感病毒哺乳动物适应性和致病性的机制

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【摘要】：动物流感病毒不仅持续危害畜牧业,给畜牧业造成严重经济损失,而且可以跨越种间障碍感染人群,给公共卫生安全构成严重威胁。因此,解析影响流感病毒在哺乳动物适应性和致病性的分子机制,对流感的防控具有重要意义。PA基因是A型流感病毒基因组的八个基因节段之一,研究表明,PA基因所编码的病毒蛋白与流感病毒的宿主特异性和适应性密切相关,但PA蛋白哪些氨基酸位点的突变而导致病毒的适应性以及致病性的改变尚未完全解析。本研究通过对NCBI数据库中H9N2亚型禽流感病毒(AIV)、新型基因重组H7N9和H10N8病毒的PA蛋白序列进行系统比对分析发现,随着时间的推移,H9N2禽流感病毒的PA-356R逐渐取代PA-356K成为绝对优势流行。而且,2013年在我国首次爆发感染人的新型重组H7N9和H1ON8病毒也都主要表现为PA-356R,而该新型重组H7N9和H10N8病毒的PA基因恰来源于H9N2AIV。PB2-627K已被广泛证明与AIV适应哺乳动物密切相关,我们发现,与禽源H7N9和H10N8病毒相比,感染人群的H7N9和H10N8病毒普遍出现PA-356R和PB2-627K共存在的现象。因此,我们推测AIV可能通过PA-356R单独或协同PB2-627K发挥作用,增强病毒对哺乳动物的适应性和致病性,最终促进了新型重组H7N9和H10N8病毒在人群的爆发。为验证PA-K356R突变增强AIV在哺乳动物的适应性和致病性这一推测,我们以一株H9N2病毒(A/chicken/Hebei/LC/2008)作为骨架,利用定点突变技术和反向遗传操作技术构建了PA-K356R单突变、PB2-E627K单突变以及PA-K356R和PB2-E627K双突变的三株重组病毒,并评价这些重组病毒在哺乳动物体内和体外的生物学特性。结果显示,PA-K356R突变显著增强H9N2病毒PA蛋白在哺乳动物细胞系上的核输入效率,聚合酶活性及基因组转录与复制能力研究结果表明,PA-K356R或PB2-E627K单突变可显著增强H9N2病毒的在哺乳动物细胞系上的聚合酶活性,以及病毒mRNA与vRNA的转录复制能力,而且PA-K356R和PB2-E627K同时存在时表现出协同增强的效果。在体外培养哺乳动物细胞系和小鼠体内感染性研究结果表明,PA-K356R或PB2-E627K单突变可以增强病毒体外和体内的复制力,以及增强病毒在小鼠的致病性,并诱导了在小鼠高水平的促炎／炎性细胞因子表达,且PA-K356R和PB2-E627K双突变表现出协同效应。因此,PA-K356R突变增强AIV在哺乳动物的适应性和致病性。最近研究发现,PA基因不仅编码PA蛋白,而且还编码PA-X蛋白。PA-X蛋白对猪流感病毒生物学特性的影响尚不清楚。为解析PA-X蛋白对猪源流感病毒生物学特性的影响,我们以H1N2猪流感病毒(SIV, A/swine/Guangdong/1222/2006)为骨架,利用定点突变技术和反向遗传操作技术构建了PA-X蛋白缺失的重组H1N2SIV,并评价这些重组病毒在体外培养猪源细胞和猪体内的生物学特性。体外研究结果显示,PA-X蛋白缺失后的重组H1N2 SIV在体外培养猪源细胞系和猪呼吸系统组织上的生长复制能力都显著减弱。体内研究结果表明,PA-X蛋白缺失后,H1N2SIV在猪体内的复制力和致病性也显著降低,且在猪群之间的传播性显著减弱。进一步的研究表明,猪流感病毒可通过PA-X的“宿主关闭”功能抑制宿主细胞的先天性免疫应答,降低了宿主的抗病毒能力,从而有利于病毒在感染宿主的生长复制。序列分析表明,PA-X蛋白的X-ORF存在两种长度：全长形式的61个氨基酸和截短形式的41个氨基酸。进一步对NCBI数据库中所有SIV的PA-X蛋白进行序列比对分析发现,自从1930年首次在猪群中分离到SIV至1985年,所有SIV的PA-X的X-ORF均表现为全长形式,随后出现X-ORF为截短形式的PA-X,而且随着时间推移,编码截短形式PA-X的SIV逐渐取代编码全长形式PA-X的SIV,并在猪群中趋于优势流行,截止到2014年,95%的SIV编码截短形式的PA-X蛋白。因此我们提出假设：截短形式的PA-X可能有助于增强SIV在猪群中的适应性?为验证截短形式的PA-X蛋白可能有助于增强SIV在猪群中的适应性这一假设,我们以一株编码截短形式PA-X的H1N2 SIV (A/swine/Guangdong/1222/2006)为骨架,构建了一株编码全长形式PA-X的重组病毒,并评价PA-X蛋白长度对这两株SIV体外和体内生物学特性的影响。研究结果显示,截短PA-X的SIV在体外培养猪源细胞系和猪呼吸系统组织上的复制能力显著强于编码全长形式PA-X的SIV。攻毒实验结果表明,截短形式PA-X有助于增强SIV在猪的复制力、致病性和传播性。进一步的研究表明,无论在感染猪体内还是体外细胞系,与全长形式的PA-X蛋白相比,截短的PA-X都拥有更强的抑制IFN表达的能力,从而降低宿主的抗病毒能力。综上所述,本研究揭示了PA-K356R可以增强AIV在哺乳动物的适应性和致病性,并初步解析了其增强AIV在哺乳动物适应性和致病性的分子机制。证明了PA-X蛋白具有抑制免疫应答的功能,从而有利于增强H1N2 SIV在猪中的适应性和致病性。而且,与全长PA-X相比,截短PA-X可进一步促进SIV在猪群中的适应性和致病性。本研究为动物源流感病毒在哺乳动物流行潜力评估和防控提供了理论依据。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
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本文编号：1271245