番茄溃疡病菌VBNC状态的诱导、复苏及机制研究

发布时间：2017-12-09 22:16

  本文关键词：番茄溃疡病菌VBNC状态的诱导、复苏及机制研究

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【摘要】：番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)是我国重要的检疫性有害生物,引起的细菌性溃疡病严重影响番茄制种业和大田生产的可持续发展。本论文根据细菌受逆境胁迫可进入“有活力但不可培养”(Viable but nonculturable, VBNC)状态的理论,设计了与番茄生产中使用铜制剂防治细菌病害、种子收获过程中使用酸处理等相关的对病原菌构成逆境胁迫的条件,系统研究了番茄溃疡病菌VBNC状态的诱导及复苏条件,并通过转录组学和定量PCR的方法,对番茄溃疡病菌VBNC状态的机制进行了探索,期望为解析番茄溃疡病菌在逆境条件下的生存策略及进一步探明田间病害的初侵染来源提供理论依据。主要结果如下：1)建立了基于SYTO 9/碘化丙啶(PI)染色的流式细胞术结合平板计数的方法,应用于VBNC状态Cmm的检测和计数。流式细胞术对Cmm的最佳计数范围为105-107 cell/ml;选用SYTO 9对Cmm进行染色,染料终浓度为50 μM,染色时间为30 min,检测通道为FL1,电压为640 V；选用P1对Cmm死菌进行染色,染料终浓度为150μM,染色时间为60 min,检测通道为FL2,电压为625 V；流式细胞仪的FSC电压模式为E00, SSC电压为440 V,放大模式为Log型,进样速度为中速,激发光波长为488 nm。2)证实了Cmm在寡营养的条件下,受低浓度铜离子和温和的酸性条件诱导可加速进入VBNC状态。在含有0.05 μM、0.5μM、5 μM和50.00 μM硫酸铜的0.85%氯化钠溶液中,Cmm分别在诱导37 d、1 d、1 d和2h后,有活力的菌体全部进入VBNC状态；在pH3.5、pH4.5和pH 5.5的0.85%氯化钠溶液中,Cmm分别在诱导3 d、35 d和107 d后,有活力的菌体全部进入VBNC状态；在不添加铜离子且pH为中性的0.85%氯化钠溶液中,有活力的Cmm在约110 d后方可全部进入VBNC状态。在试验范围内铜离子浓度越高或pH值越低,Cmmm进入VBNC状态的速度越快。3) VBNC状态的Cmm可通过去除体系中的诱导因素、添加营养物质或将其接种到寄主植株等方法进行复苏,恢复可培养性,菌体在复苏后致病力得到恢复。在VBNC诱导体系中添加终浓度为诱导使用铜离子浓度1.5倍的EDTA,可以使50州铜离子诱导2 h、5μM铜离子诱导8h和1d的VBNC状态Cmm复苏；添加0.1×LB液体培养基可以使50 pM和5μM铜离子诱导1 d以及pH 3.5诱导11 d的VBNC状态Cmm复苏；添加5%的番茄幼苗匀浆培养基可以使5μM铜离子诱导1d和5d以及pH 3.5诱导11d的VBNC状态Cmmm复苏。Cmm的LB培养液的上清液可以使50μM铜离子诱导1d的VBNC状态Cmm复苏；接种寄主番茄幼苗的方法可以使50μM铜离子诱导2 h、1 d、2 d、3 d,5μM铜离子诱导1d,以及0.5 pM铜离子诱导4d的VBNC状态Cmm复苏。上述复苏后得到的菌体接种番茄幼苗后,均具有致病性。4)利用RNA-Seq技术研究了Cmm形成及维持VBNC状态的机制,通过qPCR对sigH等16个关键基因进行了验证,并利用突变体初步探索了sigH和katA在VBNC状态Cmm中的功能。受铜离子胁迫5min-10d后,Cmm中有114个基因表达量显著上调,38个基因表达量显著下调。Cmm在铜离子胁迫下进入并维持VBNC状态的过程涉及到庞大的调控网路,σ因子(sigH)及MarR等与重金属胁迫相关蛋白家族起到了重要的调控作用,抗铜基因(如CMM_1035、 CMM_1037)、压力胁迫相关基因(如CMM 0581、CMM_0737)、严谨反应基因(如CMM_1809、CMM_465)等众多基因行使重要功能,细胞壁形成相关的多个基因(如CMM_2638)表达水平发生显著变化,虽有较活跃的能量和物质代谢,但细胞分裂相关基因(如CMM_0842、CMM_0012)受到抑制,细菌可维持活性但失去可培养性。katA的敲除使Cmm生长速率变慢,但对铜离子胁迫的反应与亲本菌株无显著差异；sigH的敲除使Cmm进入稳定期的时间延迟,对铜离子胁迫更敏感,推测sigH在Cmm的VBNC状态形成中起到了重要作用。本论文首次针对革兰氏阳性植物病原细菌开展VBNC的相关研究,并率先对植物病原细菌VBNC状态的机制进行了探索,研究结果对于丰富植物病原细菌生理学的理论体系,探明VBNC状态细菌作为田间番茄溃疡病可能的初侵染来源、改进检疫性植物病原细菌检测方法和病害综合治理具有重要的参考价值。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S436.412

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本文编号：1272050