贾第虫病毒microRNA克隆及功能研究

发布时间：2017-12-10 05:23

  本文关键词：贾第虫病毒microRNA克隆及功能研究

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【摘要】：贾第虫是一个原始的真核生物,同时也是一个重要的人兽共患病病原,具有重要的进化生物学研究价值,贾第虫作为模式生物仍然有很多问题需要解决。贾第虫病毒是由一个线形的末端开放的7.0 Kb ds RNA和100 KDa的衣壳蛋白组成。microRNA是由内含子或编码基因间隔区的RNA基因编码的,长度大小为18-24个碱基的小分子RNA,能通过与靶m RNA特异性的碱基配对引起靶m RNA的降解或抑制其翻译,从而对基因进行转录后的表达调控。但对于贾第虫病毒是否存在microRNA尚不清楚。本研究通过Solexa高通量测序及生物信息学分析结合VMIR软件预测,初步确定5条贾第虫病毒候选非编码小RNA,利用RT-PCR、Northern杂交、Dicer酶切割、荧光定量PCR等方法验证贾第虫病毒一条小RNA为贾第虫病毒的microRNA,命名为GLV microRNA1,其大小为22nt,尤为重要的是其位于pol蛋白编码区,这也是目前所发现的第一条原虫病毒的microRNA。荧光原位杂交试验显示贾第虫病毒GLV microRNA1确实存在,且定位在细胞质中,符合经典的microRNA定位。贾第虫病毒microRNA功能研究通过knock-down GLV MicroRNA1,荧光定量PCR检测发现抑制GLV microRNA1后,贾第虫病毒拷贝数增长30%左右,表明GLV microRNA1能有效控制贾第虫病毒的拷贝数。流式细胞术和激光共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜也显示,转染GLV microRNA1组贾第虫滋养体的数量及亮度均明显下降,而转染反义GLV microRNA1组贾第虫滋养体的数量及亮度均明显上升。但GLV microRNA1对贾第虫形态和生长曲线等尚未发现有明显的影响。双荧光素酶报告试验测定表明GLV microRNA1的靶标gag-pol的3'UTR发挥重要作用,同时其作用方式为切割靶序列。GLV microRNA1是目前发现的第一条位于基因的编码区域的microRNA。该发现可能进一步拓宽了人们对非编码RNA的生成方式认知,即m RNA可能需要在编码小RNA和翻译蛋白质之间有一个平衡,这种平衡可能是基因表达调控的一种新方式。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7

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本文编号：1273299