基于免疫磁泳的病原微生物分离与富集技术研究

发布时间：2017-12-10 06:04

  本文关键词：基于免疫磁泳的病原微生物分离与富集技术研究

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【摘要】：近年来,高致病性禽流感病毒和食源性致病菌等病原微生物时常引起动物疫病和食品中毒,不仅造成了巨大的经济损失,而且严重威胁了人类的公共卫生安全。有效预防和控制动物疫病和食物中毒的一个关键在于病原微生物的快速筛查,通常包括样品采集、样品前处理和微生物检测等步骤。样品采集通常可采用国家标准方法,微生物快速检测也可采用聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、侧向流动免疫分析(Strip)、生物传感器(Biosensor)等传统或新型方法。然而,动物和食品样品均比较复杂,通常需要进行有效的样品前处理才能得到准确可靠的检测结果,但是现有的过滤和离心等传统方法分别是基于大小和重量,均没有特异性,在微生物样品前处理存在较大的局限性。虽然免疫磁分离方法可特异性分离并低倍数富集目标微生物,但由于动物和食品样品中微生物浓度通常较低,故传统的免疫磁分离也很难满足动物疫病和食品安全中病原微生物的样品前处理。因此,本文旨在基于免疫磁分离方法,结合芯片实验室和3D打印技术,研究开发一种用于大体积生物样品中少量目标微生物特异分离和高效富集的免疫磁泳方法及装备,并以禽流感病毒H5N1和大肠杆菌0157:H7为研究模型开展系统参数优化和性能评价。开展的主要研究工作包括:(1)根据磁性物质在磁泳过程的受力和运动分析,通过理论推导、仿真计算、实验统计和仪器测定,建立了免疫磁泳动态模型。首先,利用COMSOL软件仿真设计了梯度磁场,分析得到了磁场强度和梯度的空间分布函数。然后,利用蒙特卡洛方法,分析模拟不同浓度和粒径磁珠在磁场状态下的成链状态,并利用荧光修饰磁珠进行验证。最后,根据磁珠磁泳受力和运动分析,建立了磁珠磁泳动态模型。(2)根据免疫磁泳动态模型,通过轨迹仿真和3D打印,建立H5N1禽流感病毒的免疫磁泳分离方法。首先,利用磁泳动态模型,仿真绘制磁病毒的磁泳运动轨迹,并优化设计磁泳分离芯片。然后,利用3D打印技术制作磁泳芯片,利用高强度NdFeB永磁体构建梯度磁场,利用高精度蠕动泵实现流体自动控制。最后,对流体速度、磁珠浓度和磁珠粒径等参数进行优化,并以灭活的禽流感病毒H5N1为研究模型,以血凝测试为病毒检测方法,开展系统性能测试,结果表明该方法可在载流体流速不大于120μL/min的条件下实现88%以上的病毒分离效率。(3)根据免疫磁泳动态模型,通过轨迹仿真、3D打印和主动式混合,建立大肠杆菌0157:H7的免疫磁泳分离方法。首先,利用磁泳动态模型,仿真绘制磁细菌的磁泳运动轨迹,并结合磁搅拌混合器,优化设计磁泳分离芯片。然后,利用3D打印技术制作磁泳芯片,利用直流电机驱动磁铁产生旋转磁场,实现了磁搅拌混合。最后,对流体速度、磁珠浓度和磁珠粒径等参数进行优化,并以大肠杆菌0157:H7为研究模型,以平板计数为细菌检测方法,开展系统性能测试,结果表明该方法可在载流体流速不大于100μL/min和磁搅拌混合时间为20 min的条件下可实现87%的细菌分离效率。本文针对动物防疫和食品安全中病原微生物样品前处理的实际需求,基于免疫磁分离技术,提出了磁泳动态模型,建立了一种可连续流动分离大体积样品中目标微生物的免疫磁泳方法,并利用禽流感病毒和大肠杆菌进行了方法验证,可为病原微生物快速检测提供一种高富集倍数的特异分离方法及装备支持。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.6;R155.5

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本文编号：1273380