活性氧和兼性共生菌在豌豆蚜免疫系统中的作用研究

发布时间：2017-12-10 14:08

  本文关键词：活性氧和兼性共生菌在豌豆蚜免疫系统中的作用研究

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【摘要】：豌豆蚜Acyrthosiphon pisum是第一个完成基因组测序的半翅目昆虫,且含有一种专性共生菌布赫氏体Buchnera aphidicola和多种兼性共生菌,因此是研究蚜虫和微生物相互作用的很好的模式昆虫。截止目前,对于豌豆蚜的免疫的研究仍十分有限。活性氧(reactive oxygen species,ROS)能够被有机体通过氧化迸发的形式迅速产生来抵御病原物的感染,之前的研究暗示活性氧可能在豌豆蚜免疫中起作用,而兼性共生菌能够保护蚜虫抵御寄生蜂和病原真菌的寄生和侵染。本研究中,我们测定了细菌感染以后豌豆蚜体内的活性氧水平以及活性氧相关基因的表达,克隆及表达了豌豆蚜过氧化物氧化还原酶1和2(A.pisum Peroxiredoxin 1,2,ApPrx1,ApPrx2)并分析了其在豌豆蚜免疫中的作用;鉴定了实验室豌豆蚜品系兼性共生菌的类型,通过存活率的比较探明了兼性共生菌对豌豆蚜免疫的影响,并测定了病原菌感染后豌豆蚜共生菌种群密度的变化。主要结果如下:革兰氏阴性菌绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa和革兰氏阳性菌藤黄微球菌Micrococcus luteus感染均能造成豌豆蚜显著死亡,而绿脓杆菌感染后豌豆蚜的死亡率更加显著。绿脓杆菌和藤黄微球菌的感染均能诱导蚜虫体内活性氧水平升高,相比之下,藤黄微球菌感染后24小数内蚜虫体内活性氧水平升高的更加剧烈。包括催化活性氧产生的双氧化酶(dual oxidase,DUOX)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)以及活性氧解毒酶过氧化物氧化还原酶在内的多个基因在细菌感染后均有不同程度的差异表达,上调和下调因感染后时间的不同而不同。重组ApPrx1和ApPrx2蛋白均具有抗氧化活性,能够有效清除过氧化氢,保护DNA免受氧化损伤。当蚜虫被细菌感染或注射过氧化氢时,ApPrx1和ApPrx2的转录显著上调。通过显微注射dsRNA对ApPrx1和ApPrx2进行RNA干扰,结果显示,ApPrx1和ApPrx2的表达均在注射后第三天显著降低,对ApPrx1和ApPrx2的干扰效率分别约为35%和50%。通过RNA干扰降低ApPrx1表达之后,藤黄微球菌感染的蚜虫的存活率显著降低,注射dsApPrx1的蚜虫被细菌感染后其体内的细菌数在48 h显著低于对照,而其体内的过氧化氢水平则显著高于对照。干扰ApPrx2表达后,金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus感染的蚜虫的存活率显著降低,绿脓杆菌感染的蚜虫的存活率无显著变化,金黄色葡萄球菌感染的蚜虫体内的过氧化氢水平更高而细菌数目较低,绿脓杆菌感染后细菌数目无显著变化,表明干扰ApPrx1和ApPrx2后蚜虫存活率的降低是由于氧化胁迫升高导致的。通过PCR检测实验室豌豆蚜品系中的兼性共生菌类型,检测到只含有Serratia symbiotica这一种兼性共生菌。显微注射氨苄青霉素清除S.symbiotica建立了稳定的无兼性共生菌豌豆蚜品系。利用三种革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae以及三种革兰氏阴性细菌绿脓杆菌、粘质沙雷氏菌Serratia marcescens和大肠杆菌Escherichia coli对含S.symbiotica和不含S.symbiotica的两个品系蚜虫进行感染,比较其存活率,发现S.symbiotica的有无对于6种细菌感染下的蚜虫的存活率均无显著影响。球孢白僵菌Beauveria bassiana感染后的两个品系的蚜虫的存活率也无显著差异。检测细菌感染以后豌豆蚜体内共生菌的密度发现,S.symbiotica在蚜虫感染不同细菌后均升高约2-3倍,而专性共生菌B.aphidicola仅在蚜虫感染革兰氏阳性菌(特别是藤黄微球菌)后显著升高。相比细菌感染,球孢白僵菌的感染并不引起蚜虫体内S.symbiotica和B.aphidicola的密度的变化。这些结果表明,兼性共生菌S.symbiotica并不影响豌豆蚜对细菌和真菌侵染的敏感性。综合以上结果,我们初步证明了活性氧在豌豆蚜抵御细菌感染时能够发挥作用,而过氧化物氧化还原酶在调节豌豆蚜受感染时维持活性氧稳态中起重要作用。兼性共生菌S.symbiotica对豌豆蚜抵御细菌和真菌B.aphidicola的感染中并不起保护作用,但S.symbiotica和B.aphidicola能够以增加自身的数量作为对外界细菌感染豌豆蚜的反应。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433

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本文编号：1274735