PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究

发布时间：2017-12-10 20:18

  本文关键词：PRRSV与PCV2的分子流行病学调查及其重组腺病毒疫苗实验免疫研究

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【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)已经成为中国流行比较严重的猪病之一,特别是2006年爆发的高致病性PRRSV,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前国内PRRSV流行毒株仍以美洲型为主,但在2011年以后随着欧洲型毒株在国内密集报道,证实国内也存在欧洲型毒株流行。PCV2是无囊膜单链DNA病毒,可分为PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d四个亚型。PCV2是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原体,临床上常见PRRSV和PCV2混合感染,推测二者可能存在协同作用,导致猪死亡率增高。PRRSV和PCV2混合感染实验证实,PCV2复制增强可以导致PRRSV对肺组织损伤的严重性增强。本研究首先对2015-2016年广西猪场PRRSV和PCV2的流行情况进行监测,并分析其遗传变异情况;然后利用腺病毒载体构建PRRSV和PCV2重组腺病毒候选疫苗;最后,利用小鼠和猪体对重组候选疫苗进行免疫评价。主要研究结果如下:(1)对2015-2016年广西地区PRRSV和PCV2流行病学调查发现,2015年广西部分地区PRRSV和PCV2血清阳性率分别为63%-90%和85%-93%。对广西玉林市2014年-2016年PRRSV和PCV2跟踪调查发现连续三年的PRRSV抗体阳性率出现持续性下降。猪群体免疫不均匀或者免疫效果不佳更容易造成病毒变异,给疾病的预防和净化造成巨大的障碍。本研究发现7株PRRSV均属于美洲型高致病性毒株,且属于2个不同基因亚群。GXB11-2015分离株存在2处不连续150个核苷酸缺失,氨基酸缺失特征为1+20+29。获得27株PCV2全基因组序列,分析表明PCV2d可能成为中国广西猪场的优势毒株。重组分析发现3处基因重组现象,压力选择分析表明ORF2更容易受到阳性筛选。(2)本实验以美洲型经典VR2332株和HP-PRRSV GD株的ORF3、ORF5基因,欧洲型代表株LV株ORF3、ORF5基因及PCV2NM株ORF2基因为基础,利用穿梭质粒pacAd5K-NpA,成功构建美洲型重组腺病毒rAd-NAORF3-ORF5、欧洲型PRRSV和美洲型PRRSV二价重组腺病毒rAd-EUORF3-ORF5-NAORF3-ORF5、美洲型 PRRSV 和 PCV2 二联重组腺病毒rAd-ORF2-NAORF3-ORF5、欧洲型PRRSV和PCV2二联重组腺病毒rAd-ORF2-EUORF3-ORF5 以及含有 IL18 细胞因子的 rAd-NAORF3-ORF5-IL18和rAd-EUORF3-ORF5-IL18,并对重组腺病毒进行筛选鉴定。(3)小鼠免疫试验结果表明,ORF5和ORF3具有免疫协同作用,可以促进机体细胞免疫水平和体液免疫水平。IL18作为细胞因子佐剂可以促进腺病毒 rAd-NA-ORF3-ORF5-IL18、rAd-EU-ORF3-ORF5-IL18、rAd-ORF2-IL18的免疫效果。PRRSV-PCV2二联重组腺病毒疫苗rAd-ORF2-NA-ORF3-ORF5、rAd-ORF2-EU-ORF3-ORF5能刺激小鼠细胞Th1类和Th2类细胞免疫反应。(4)猪体免疫试验结果表明,PRRSV-PCV2重组腺病毒疫苗能诱导猪体产生较好的体液和细胞免疫反应。免疫第35天时rAd-EU-ORF3-ORF5-NA-ORF3-ORF5免疫组CD4+T淋巴细胞的水平显著高于野毒组1.46倍(P0.05)。LV株病毒攻毒后,野毒免疫组血液中的病毒载量高于rAd-NA-ORF3-ORF5-EU-ORF3-ORF5 3.5 倍(P0.05)。攻毒保护实验表明,重组腺病毒疫苗能够提供有效的免疫保护,表明所构建的重组疫苗在抵抗PRRSV和PCV2病毒感染方面具有很好的发展潜力。综上所述,我国的PRRSV和PCV2毒株不断发生新的变化,PRRSV外来毒株的及PCV2基因型的漂变给疾病的预防和控制带来巨大的挑战。本研究丰富了当前PRRSV及其PCV2分子流行病学资料;利用腺病毒载体构建欧洲型、美洲型PRRSV及其PCV2重组候选疫苗能够在小鼠和猪体免疫中诱导特异的体液和细胞免疫,攻毒保护实验证明可以提高对仔猪的保护水平,从而为PRRSV和PCV2基因工程疫苗的研究奠定了基础。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.28
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本文编号：1275771