PRRSV遗传变异分析及其nsp2蛋白的定量相互作用组学研究

发布时间：2017-12-10 22:04

  本文关键词：PRRSV遗传变异分析及其nsp2蛋白的定量相互作用组学研究

  更多相关文章： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 流行病学 遗传变异 同源重组 SILAC LC-MS/MS

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)主要以妊娠母猪发生明显的繁殖障碍以及仔猪出现严重的呼吸系统疾病和生长迟缓为主要特征,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起一种严重危害全球养猪业的病毒性传染病。尤其是2006年由高致病性PRRSV(HP-PRRSV)引发的猪“高热病”给我国养猪业造成了沉重的打击。之后,2009年、2011年和2015年PRRS在我国都出现不同程度的暴发。此外,2015年来自美国的NADC30-like毒株在我国不同省份引发母猪严重的流产或早产。因此,非常有必要对我国PRRSV流行病学、基因变异和同源重组等情况进行跟踪调查,并掌握PRRSV的遗传变异规律,为PRRSV的防控提供理论基础。PRRSV nsp2蛋白作为PRRSV最大的非结构蛋白,也是PRRSV基因组中突变率最高的蛋白之一,可以通过对nsp2基因的监控,以达到了解PRRSV的遗传演化和变异规律的目的,更重要的是,nsp2能够在病毒复制和免疫调控方面都发挥着非常重要的作用,因此,本研究利用定量相互作用组学的方法对与nsp2相互作用的其他病毒蛋白和宿主蛋白进行LC-MS/MS鉴定。主要研究内容包括:1.PRRSV流行病学调查及新毒株的分离鉴定2010年至2015年间在我国东南17省收集了1909份临床样品,对其进行流行病学调查,其中PRRSV经典株的阳性率仅为3.87%,而HP-PRRSV毒株的阳性率高达43.48%,且呈逐年下降趋势。发现我国PRRSV的流行趋势逐渐从以HP-PRRSV毒株的流行为主,变为以NADC30-like毒株的流行为主,并且有两种毒株共感染的情况存在。同时发现猪的粪便样品中也能检测到PRRSV,阳性率可达43.97%,并从中分离到一株HP-PRRSV:WUH4株,推测PRRSV可以通过粪-口途径传播这一新方式。此外,2014年以后在临床上检测到了PRRSV NADC30-like毒株的流行,阳性率高达63.04%。在PRRSV NADC30-like阳性样品中,成功地分离到PRRSV WUH5和WUH6两株毒株。全基因组及各个蛋白序列比对分析,发现WUH5和WUH6株在nsp2的HV区域都存在130个氨基酸的不连续缺失。通过同源重组进一步分析,发现WUH6株为重组毒株,并推测其亲本可能为NADC30和JXA1株,其中间重组区域与JXA1毒株高度同源,而两端区域与NADC30毒株有较高的相似度。2.PRRSV nsp2定量相互作用组学研究利用SILAC结合IP实验的定量相互作用组学技术,在PRRSV感染的条件下对与nsp2蛋白相互作用的蛋白进行串联质谱(LC-MS/MS)分析,鉴定出9个病毒蛋白和62个宿主蛋白能够与nsp2发生特异性互作,并利用IPA软件对与nsp2互作的62个宿主蛋白进行相互作用网络分析,进而生成了nsp2互作网络图。在PRRSV感染和超表达条件下对病毒蛋白与nsp2之间的相互作用进行了验证,实验证实nsp2能够与nsp1α、nsp1β和N发生相互作用,而nsp2与GP5只在病毒感染条件下有间接的相互作用。同时,在PRRSV感染和超表达条件下对宿主蛋白与nsp2之间的相互作用进行了验证,实验证实nsp2能够与YWHAB、YWHAZ和MARK2分别发生相互作用,而nsp2与vimentin只在病毒感染条件下有间接的相互作用。但是,有趣的是,通过实验Co-IP实验证实了作为PRRSV受体之一的vimentin能够与nsp2和N蛋白能够形成一个蛋白复合体,其中N蛋白起着桥梁的作用。在N蛋白的存在下,nsp2与vimentin蛋白能够相互地发生相互作用,而N蛋白不存在的条件下,nsp2与vimentin蛋白之间没有相互作用。此外,通过RNA干扰实验证实干扰宿主蛋白YWHAB、YWHAZ、MARK2或vimentin能够显著地降低PRRSV在Marc-145细胞中的复制。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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