抗停乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染的表位疫苗构建及免疫原性评价

发布时间：2017-12-11 13:28

  本文关键词：抗停乳链球菌和金黄色葡萄球菌感染的表位疫苗构建及免疫原性评价

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【摘要】：奶牛乳房炎主要是由病原微生物引起的奶牛乳腺炎症,给奶牛业造成了巨大的经济损失。引起奶牛乳房炎的病原菌众多,其中以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)和链球菌引起的奶牛乳房炎最为常见。目前,临床抗生素疗法无法控制金黄色葡萄球菌和链球菌感染,疫苗研制迫在眉睫。研究证明,在预防金黄色葡萄球菌和链球菌感染过程中细胞免疫应答发挥主要作用,尤其在预防金黄色葡萄球菌感染中以Th1和Th17细胞免疫应答为主,因而启动CD4~+T细胞应答对于设计有效预防奶牛乳房炎疫苗至关重要。抗原诱导免疫应答发挥关键作用的部分是抗原表位,因此构建能够启动CD4~+T细胞并诱导分化为Th1/Th7类型免疫应答的表位疫苗可能会有效预防链球菌和金黄色葡萄球菌的感染。停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae,S.dysgalactiae)GapC和金黄色葡萄球菌TRAP蛋白能够诱导特异性细胞免疫应答且高度保守,而GapC和TRAP的CD4~+T细胞表位未见报道,对于包含停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的CD4~+T细胞表位和B细胞表位的表位疫苗也未见报道。因此,本研究首先对GapC和TRAP的CD4~+T细胞免疫优势表位进行筛选,构建涵盖GapC和TRAP的免疫优势CD4~+T细胞表位和B细胞表位的多表位疫苗,以期获得一种能够同时有效预防链球菌和金黄色葡萄球菌感染的新型疫苗。本研究通过预测GapC和TRAP蛋白与MHCⅡ的亲和力,结合目标蛋白质的二级结构及其保守序列分析筛选并分别合成6个GapC(15-mer)和5个TRAP(20-mer)的候选表位肽,分别以候选表位刺激免疫蛋白或表位的BALB/c(H-2d)和C57BL/6(H-2b)小鼠的CD4~+T细胞,检测CD4~+T细胞增殖水平和细胞因子分泌水平,并对鉴定表位的保守性进行分析。结果显示:GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP_(94-113)能够诱导特异性的CD4~+T细胞增值,同时分泌了高水平的IFN-γ和IL-17A,与PBS免疫组之间存在极显著差异,表明鉴定的表位主要引起Th1和Th17型免疫反应,证实GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP(94-113)分别为GapC和TRAP的CD4~+T细胞表位,且鉴定表位高度保守。在上述研究基础上,将获得的CD4~+T细胞表位GapC_(63-77)、TRAP_(20-39)、TRAP_(94-113)分别与实验室前期鉴定的B细胞表位GapC_(30-36)、GapC_(48-57)、GapC_(97-103)和TRAP_(154-163)进行串联,并将氨基酸序列对应的目标基因进行合成,将目标基因插入pET32a载体中,构建含有多个表位的重组质粒,诱导表达并纯化重组蛋白,制备重组表位疫苗PT、PG和PTG。将构建的表位疫苗免疫BALB/c和C57BL/6小鼠后进行免疫原性分析。通过淋巴细胞增殖试验、细胞因子的检测评价表位疫苗的细胞免疫效果;通过抗体水平检测、调理吞噬试验评价表位疫苗的体液免疫效果;通过攻毒试验评价表位疫苗的免疫保护效果。结果显示:表位疫苗PT、PG和PTG能够诱导特异性的淋巴细胞增值,同时,特异性淋巴细胞分泌的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17A水平显著高于pET32a对照组,说明表位疫苗可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫应答;表位疫苗PT、PG和PTG产生的抗TRAP和GapC的IgG抗体水平显著高于pET32a对照组,且特异性抗体对于停乳链球菌和金黄色葡萄球菌具有一定的调理吞噬作用,说明表位疫苗可诱导小鼠产生特异性的体液免疫应答;攻毒实验结果显示表位疫苗PT、PG和PTG具有良好的免疫保护效果,其中表位疫苗PT能够较好的抑制金黄色葡萄球菌感染,而PG能够部分抑制停乳链球菌感染,PTG能够部分抑制停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的感染。上述结果表明,构建的表位疫苗使包含的CD4~+T细胞表位及B细胞表位各自发挥功能,可为奶牛乳房炎疫苗的深入研究提供参考。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23

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本文编号：1278640