两种中国原产百合体细胞胚发生及miRNA调控网络初步解析

发布时间：2017-12-11 23:11

  本文关键词：两种中国原产百合体细胞胚发生及miRNA调控网络初步解析

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【摘要】：百合是世界著名球根花卉,具有较高的观赏价值、药用价值和食用价值。目前我国在百合生产上还存在许多问题,如种球尚未实现国产化,国内拥有自主知识产权的品种尚少,种质保存方面存在很大困难,大量珍贵野生资源濒临灭绝等。体细胞胚发生对于百合种质保存、遗传性状改良、种球繁育等领域具有重要意义,但目前有关百合体细胞胚发生的研究主要集中在植物生长调节剂和培养基筛选等,尚未涉及相关机制探索研究,仅有少数百合成功获得体细胞胚但尚不能应用于生产实践。研究表明,miRNA对植物体细胞胚发生中涉及的庞大基因网络起重要的调控作用,但miRNA介导植物体细胞胚发生的调控机制尚不明确。本研究旨在构建百合体细胞胚发生小RNA库,筛选并挖掘百合体细胞胚发生中关键miRNA,为明确百合体细胞胚发生miRNA-靶基因调控网络,阐明miRNA介导百合体细胞胚发生的调控机制奠定基础。主要研究结果如下:1.成功诱导细叶百合和兰州百合体细胞胚发生,并对两种百合体细胞胚进行了组织形态学鉴定和碳水化合物含量测定。试验结果表明:以两种百合无菌苗鳞片为外植体,诱导胚性愈伤组织的最适培养基为MS+1.0mg·L-1毒莠定(picloram)+0.2mg·L-1萘乙酸(NAA),细叶百合和兰州百合胚性愈伤组织诱导率分别达100%和76.7%,两种百合单个无菌苗鳞片可分别获得11个和6个体细胞胚。组织形态学鉴定结果表明,胚性细胞和非胚性细胞在细胞形态上有明显差异,胚性细胞核大、质浓且富集了大量淀粉粒,而非胚性细胞则由细胞核不明显的薄壁细胞构成;百合体细胞胚发育存在外起源和内起源两类方式,其中外起源方式的球形胚起源于外表层或亚表层细胞,而内起源方式的球形胚均起源于内层细胞,但在随后发育中分为始终包埋于内层细胞、突破内层细胞或突破外表层细胞3种方式;表皮原细胞、两极分化和胚柄类似结构等指示因子的出现进一步验证了百合体细胞胚发生途径。两种百合不同阶段胚性培养物淀粉、蔗糖、果糖、葡萄糖和可溶性蛋白质含量测定结果表明,百合体细胞胚发生伴随活跃的碳水化合物代谢。2.构建了细叶百合和兰州百合体细胞胚发生cDNA文库,分别获得66,422和35,450条Unigene,其中细叶百合和兰州百合中分别有47,900条和28,573条Unigene获得GO注释,两种百合中共总结发现42条与胚发生相关的GO类别,涉及Unigene数量最多的为种子休眠过程中胚发育终止、根发育、胚发育、胚囊发育和种子萌发。经与KEGG数据库比对,细叶百合和兰州百合体细胞胚发生分别涉及341和319条KEGG代谢通路,其中涉及Unigene数量较多的为核糖体加工、碳代谢、氨基酸合成、淀粉-蔗糖代谢和植物激素信号传导等。3.构建了细叶百合和兰州百合体细胞胚发生小RNA库,分别比对获得2,378,760和1,727,322条sRNA,序列长度以24nt所占比例最多,各样品间以子叶形胚时期sRNA最活跃。经与miRBase数据库比对,细叶百合中共鉴定得到分属于超过86个家族的452个已知miRNA,兰州百合中鉴定得到314个已知miRNA,分属于超过47个miRNA家族。其中两种百合均以miR159家族包括的成员个数最多,且该miRNA家族表达丰度最高。将百合中miRNA家族与24种陆生植物同源序列比对,两种百合miRNA家族保守性均分为高度保守、中度保守、低度保守和特异性四个等级。细叶百合和兰州百合中分别有389和273个已知miRNA预测到相应靶基因,且miRNA和靶基因对应关系较为复杂。此外,两种百合靶基因GO和KEGG富集结果显著不同。4.以两种百合体细胞胚发生不同阶段胚性培养物为试材,以17个miRNA、2个snRNAs、1个rRNA和3个常用内参基因为候选内参基因,经过geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder等4款内参基因分析软件综合评价候选内参基因的表达稳定性,筛选获得百合体细胞胚发生中miRNA荧光定量表达检测的最适内参。试验结果表明,细叶百合体细胞胚发生中,以miR159a为最适内参基因,其次为miR408b,而U6为表达稳定性最差的内参基因;对兰州百合体细胞胚发生而言,FP表达稳定性优于一半以上miRNA候选内参基因,但仍以miR162表达稳定性最佳,其次为miR159a。最后以miR156和miR529表达模式分析验证两种百合候选内参基因的稳定性。两种百合体细胞胚发生中,与蛋白编码基因和snRNA、rRNA等传统内参基因相比,候选miRNA内参基因表达稳定性更优越,且同属不同种的百合中最适内参基因不同。5.筛选了两种百合体细胞胚发生中差异表达的miRNA,并对部分差异miRNA及其靶基因的表达模式进行qRT-PCR验证,结合靶基因注释对差异miRNA和靶基因参与百合体细胞胚发生的功能进行了初步分析。结果表明,细叶百合和兰州百合中筛选的24个miRNA和12个靶基因表达模式复杂多变,miRNA和靶基因表达模式呈现一定负相关性。其中细叶百合miR394a和miR528a分别对应BGA6和SSG可能参与碳水化合物代谢,兰州百合miR167、miR397和miR408分别负调控WRKY、LAC参与调控胚性细胞细胞分裂和细胞壁木质素合成,两种百合miR395和miR396均分别对应调控FtsZ和GRF参与胚性愈伤组织和子叶形胚形成。差异miRNA和靶基因表达模式的分析是构建百合体细胞胚发生miRNA-靶基因复杂调控网络的必要前提,为阐释miRNA相关功能奠定了基础。综上,本研究成功诱导了细叶百合和兰州百合体细胞胚发生,基于组织形态学观察和碳水化合物含量测定总结了两种百合体细胞胚发育形态学特点和碳水化合物变化规律,借助高通量测序技术,挖掘大量与百合体细胞胚发生相关的miRNA及靶基因,定量检测了差异miRNA和靶基因表达模式,为揭示miRNA介导百合体细胞胚发生的机制提供了依据。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S682.29
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本文编号：1280269