性类固醇激素对尼罗罗非鱼雌雄生长差异与生长相关基因表达的影响

发布时间：2017-12-12 04:03

  本文关键词：性类固醇激素对尼罗罗非鱼雌雄生长差异与生长相关基因表达的影响

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【摘要】：因为具有生长快、食性杂和适应性强等特点,罗非鱼已成为世界重要养殖鱼类。其雌雄生长差异明显,雄性生长快、个体大,而雌性生长慢、个体小;性成熟前雄鱼较雌鱼生长快,性成熟后更加明显,部分原因可能性有:性类固醇激素水平、生长与生殖能量配置、摄食消化等差异。本论文以尼罗罗非鱼为实验对象,首先比较了性成熟前雌雄鱼生长特征与性类固醇激素分泌水平关系;通过体外注射性类固醇激素,分别研究了性类固醇激素对生长轴相关基因、生肌因子、摄食基因的表达调节影响;最后比较了雌雄鱼性类固醇激素受体表达差异,旨在为罗非鱼雌雄性别生长差异的调节机理研究提供资料,主要结果如下:(1)利用分子标记法、醋酸洋红压片法、组织切片技术等方法进行个体性别鉴定,比较了性成熟前期(0.5~4月龄)尼罗罗非鱼雌、雄鱼生长差异,并检测了2.5~4.0月龄雌、雄鱼血清睾酮(T)、雌二醇(E_2)激素含量。结果发现,雌、雄鱼全长、体重分别自3.0月龄、2.5月龄开始出现差异显著(P0.05)。Logistic拟合全长、体重生长方程为:Lt(♀)=16.443/(1+e~(2.821-1.363*t)),Lt(♂)=18.248/(1+e~(2.752-1.295*t));Wt(♀)=107.704/(1+e~(5.157-1.464*t),Wt(♂)=134.796/(1+e~(5.080-1.417*t),雌、雄鱼全长、体重的拟合度均大于0.94,拟合效果均较好。随着月龄增加,雌、雄鱼全长、体重差异逐渐增大,全长生长速度最大时月龄为2.069和2.125,全长生长曲线不具拐点,随着月龄的增加,逐渐趋向渐进值;体重的拐点月龄为3.523和3.585,拐点体重值为52.352g和67.398g,雄鱼体重拐点月龄与拐点体重值均大于雌鱼。对Logistic方程求一阶导数和二阶导数,分别得雌、雄鱼生长速度、生长加速度。雌、雄鱼的全长、体重生长速度均是先上升后下降,随着生长发育,雌、雄鱼体重差异逐渐增大,体重生长速度的差异也逐渐增大。雌、雄鱼全长、体重生长加速度变化规律类似,呈上升-下降-再上升趋势。在全长生长速度最大时,加速度为零,此后为负值,生长速度减小。体重生长加速度的最大值和最小值(两个极值)分别对应始速点和终速点,相应分为三个时期:缓慢生长期、快速生长期和渐进生长期,雌鱼进入快速生长期的始速点(2.623月龄)和终速点(4.422月龄)都比雄鱼(2.655月龄,4.514月龄)提前,雄鱼快速增长期的净增长量(77.831g)和快速增长期持续时间(1.859月)大于雌鱼(1.799g,60.525月),雄鱼体重增加显著大于雌鱼。2.5月龄之后,雌、雄鱼E_2含量差异显著(P0.05),3月龄之后,雌、雄鱼T含量差异显著(P0.05),雄鱼雄激素水平高、雌激素水平低,生长更快;而雌鱼雄激素水平相对低,雌激素水平高,生长较慢,这可能与雌、雄鱼在性腺发育过程中进行的生殖投入不同有关。推测E_2、T含量差异是引起尼罗罗非鱼雌雄性别生长差异的原因之一。(2)采用体外注射雌二醇、睾酮的方法结合荧光定量PCR方法,比较了E_2和T对雌雄尼罗罗非鱼的生长、摄食、血清性类固醇激素水平、肝脏GH-IGF生长轴基因、肌肉生肌因子基因表达量的影响,结果表明:对照组雄鱼较雌鱼T水平更高,E_2水平更低。E_2注射后升高血清E_2水平,T注射后升高血清T水平,对照组雌鱼较雄鱼生长率较低,E_2促进雌鱼生长,对雄鱼生长影响不明显,T显著促进雄鱼生长,对雌鱼生长影响不明显;E_2显著促进雌鱼igf1,igf2,ghr1,ghr2表达;但不显著影响雄鱼igf1,igf2,一定程度降低ghr1,ghr2表达T对雄鱼作用大于雌鱼;显著升高雄鱼igf1,igf2,ghr1,ghr2表达;升高雌鱼ghr1,ghr2表达,显著降低igf2表达。E_2显著升高雌鱼myod1,myf5表达量,T显著升高雄鱼myod1,myod2,myf5表达量,E_2降低雄鱼myog2,myf5表达量,不影响myod1表达量,T升高雌鱼myog表达量,不显著影响myod1,myod2表达量。性类固醇激素对GH-IGF生长轴、生肌因子相关基因表达有一定的作用,这种作用表现出明显的雌雄差异性,推测性雌雄类固醇激素水平不同可能是导致雌雄个体生长差异显著的一个重要原因。(3)摄食与消化水平是影响鱼类生长的重要环节。通过体外注射雌二醇(E_2)、睾酮(T),测定注射后6h、12h、24h尼罗罗非鱼雌雄鱼消化酶(胃蛋白酶、肠淀粉酶、肠脂肪酶)活性,并采用荧光定量PCR方法,比较脑组织ghrelin、leptin、orexin、NPY、CCK mRNA表达量的差异。结果表明,注射后24h,T显著提高雄鱼淀粉酶活性(P0.05);注射E_2和T后12h,对照组三种消化酶活性均升高,且此时对照组雄鱼淀粉酶、脂肪酶活性较雌鱼高(P0.05)。注射后6h、12h、24h,E_2显著升高雌鱼ghrelin、NPY mRNA表达量(P0.05),但不显著影响雄鱼,E_2降低雌鱼leptin mRNA表达量,6h时E_2升高雄鱼leptin mRNA表达量(P0.05),12h、24h影响不明显;注射T显著升高雄鱼ghrelin、NPY mRNA表达量(P0.05),但不显著影响雌鱼,降低雄鱼leptin mRNA表达量,6h、24h时T显著升高雌鱼leptin mRNA表达量,12h时影响不明显;24h时E_2显著升高雌鱼orexin表达量(P0.05),其他时间点影响不显著,24h时T显著升高雄鱼orexin表达量(P0.05),其他时间点影响不显著;6h、12h、24h时E_2显著降低雌鱼CCK mRNA表达量,T显著降低雄鱼表达量。结果表明,E_2显著升高雌鱼、T显著升高雄鱼促摄食基因表达量降低抑制食欲基因表达量,对雌雄鱼脂肪酶、蛋白酶影响不明显,摄食基因可能参与了性类固醇激素对雌雄尼罗罗非鱼生长的调节。(4)采用Western-blot、免疫组化、荧光定量PCR的方法,对尼罗罗非鱼雌雄鱼肝脏、性腺、肠、肾脏进行雌雄激素受体(ER、AR)基因、蛋白质表达水平进行了比较,Western-blot表明:性腺(精巢、卵巢)ER蛋白表达量最高,肠、肾脏中差异不明显,雌雄鱼肝脏中ER蛋白表达量差异明显(P0.05),卵巢和精巢ER蛋白表达量差异明显(P0.05);卵巢和精巢AR蛋白表达量差异明显,雌雄鱼肾脏AR蛋白表达量差异明显,性腺(精巢、卵巢)AR蛋白表达量最高。免疫组化结果表明:雌雄鱼性腺、肠、肾中均检测到了ER和AR免疫阳性反应,雌鱼肝脏阳性细胞主要分布在中央静脉附近,雌鱼肝脏未发现AR阳性反应,雄鱼肝脏未发现ER阳性反应;雄鱼肠免疫阳性细胞主要分布在肠绒毛和肠粘膜下层;雌鱼肾ER较雄鱼阳性反应增强,雄鱼肾AR较雌鱼阳性反应增强,免疫阳性反应主要分布在肾小管中;卵巢ER阳性细胞分布在滤泡膜周围,且其ER阳性反应较雄鱼明显,精巢AR阳性细胞分布在精小管周围,且其AR阳性反应较雌鱼明显。荧光定量PCR结果表明:在四种组织中均可检测到ER mRNA表达,AR也可在四种组织中监测到,并且在性腺中表达量最高,雄鱼肠道、肾脏表达量高于肝脏。相同组织中,雌鱼卵巢、肝脏ER mRNA显著高于雄鱼(P0.05);雄鱼精巢、肠组织AR mRNA表达量显著高于雌鱼(P0.05)。推测肝脏处于性类固醇激素对雌雄生长调节的关键位置,雌雄鱼性腺ER差异明显,且雌雄鱼AR差异明显,性类固醇激素受体参与性腺发育,且对雌雄生长同时有调节作用。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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