牛奶中四种大环内酯类药物残留免疫检测技术研究
本文关键词：牛奶中四种大环内酯类药物残留免疫检测技术研究
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【摘要】：大环内酯类(Macrolides, MALs)抗生素对葡萄球菌、链霉菌等大多数革兰氏阳性菌和支原体具有突出的抗菌活性,在兽医临床上主要用于预防和治疗畜禽呼吸道和消化道疾病,但由于MALs药物可引起耳毒性和肾毒性等毒副作用,严重威胁人体健康,近年来在动物性食品中的残留问题日益引起国内外的关注。本论文开展了MALs多残留快速检测的免疫分析方法研究,为动物性食品中MALs残留监控提供技术支撑。本文制备了替米考星(Tilmicosin, TIM)多抗,其IC50值为1.1μg/L,对泰乐菌素(Tylosin, TYL)的交叉反应率为45.8%。同时,我们还探讨了同源包被原和异源包被原对抗体灵敏度的影响。结果表明包被原的异源性与灵敏度有直接关系。建立了牛奶中MALs多残留同时检测的胶体金免疫层析方法。对胶体金标记抗体体系、抗原包被体系、材料工艺体系、加样方式等主要因素进行了筛选和优化；考察了胶体金快速检测产品的区域样本适应性,低温抗干扰能力,加速和长期稳定性。该方法对红霉素(Erythromycin, ERY)、螺旋霉素(Spiramycin, SPI)、TIM和TYL的cut-off值分别为5、5、10和20μg/L。牛奶样本无需前处理,同步检测四种药物的时间在10 min以内,假阳性率和假阴性率均为0。长期稳定性试验结果表明：MALs胶体金试纸条的有效期可达12个月。建立了牛奶中MALs多残留同时检测的荧光微球免疫层析方法。筛选适合标记的荧光微球,对荧光微球标记抗体体系、抗原包被体系、材料工艺体系、加样方式等主要因素进行优化确定。研究了反应体系的放大稳定性、低温抗干扰能力,加速和长期稳定性。在紫外灯下肉眼观察,该方法检测牛奶中ERY、SPI、TIM、TYL的cut-off值分别为2.5、2.5、2.5和5μg/L。牛奶样本简单稀释,同步检测四种药物的时间在20 min以内。通过荧光信号读数仪分析,该方法对牛奶中ERY、SPI、TIM和TYL的检测限均为0.13 μg/L。 ERY、SPI和TIM在1.25-5μg/L添加水平的回收率分别在91.8-109.2%、89.6-114.4%和84.8-111.6%之间,变异系数分别在5.4-11.3%,7.9-15.7%和6.2-13.7%之间。TYL在2.5-10μg/L添加水平的回收率为85.8-115.2%,变异系数为8.5-14.9%。长期稳定性试验表明,MALs荧光微球试纸条有效期可达12个月。建立了牛奶中四种MALs残留检测的ELISA试剂盒技术。对影响方法性能的各个参数进行优化。包括抗原、抗体的浓度,反应时间、温度,反应体系pH值、离子浓度、有机溶剂、样本前处理等。该方法对牛奶中ERY、SP1、TIM和TYL的检测限分别为0.272、0.609、0.358和0.962μg/L。ERY、SPI、TIM和TYL在1.0-4.0μg/L添加水平的回收率分别在72.8-103.7%、75.3-106.8%、84.9-113.6%和75.2-105.7%之间,变异系数分别在5.4-11.8%、6.6-9.4%、3.7-10.3%和6.6-12.3%之间。稳定性试验结果表明：ELISA试剂盒在4℃条件下保存的有效期可达12个月。采用建立的胶体金免疫层析方法、荧光微球免疫层析方法和ELISA方法检测20份牛奶盲样,并与HPLC-MS/MS方法的检测结果进行比较。结果表明,建立的三种免疫分析方法检测结果与HPLC-MS/MS方法测定结果的相关系数(R2)均0.99,相关性良好,说明建立的免疫学方法准确性高,可靠性好。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S859.84
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，本文编号：1283066
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