无乳链球菌三个表面蛋白的重组截短表达及对罗非鱼和大菱鲆的免疫效果

发布时间：2017-12-13 10:28

  本文关键词：无乳链球菌三个表面蛋白的重组截短表达及对罗非鱼和大菱鲆的免疫效果

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【摘要】：曾被认为是牛乳腺炎和新生儿重要病原菌的无乳链球菌(Stepatococcus agalactiae),近年来却引起了世界各地多种鱼类的爆发性感染和死亡,且无乳链球菌存在种间交叉传播和人-兽-鱼共患的危险;而人类对鱼类的消费,也显著增加了人类受Ia和Ib血清型无乳链球菌感染的风险。自2004年起,中国已成为世界上最大的罗非鱼养殖国家,其产量占世界总产量的1/3。然而链球菌病严重影响我国罗非鱼产业发展,造成巨大的经济损失。自2009年起,无乳链球菌已替代海豚链球菌(S.iniae)成为我国以罗非鱼为代表的鱼类链球菌病的首要致病菌,罗非鱼发病规格更呈小型化趋势,传播区域日渐扩散。近年来,新增的受感染种类亦时有报道,一些冷水性鱼类、海水鱼类均有发病,防控不当将累及我国大部分鱼类生产企业。大菱鲆(Scophthalmus maximus)是重要的商业海水养殖鱼类,山东半岛为中国大菱鲆主产区,近年来也有多起无乳链球菌感染致突眼病的现象,危害大菱鲆养殖业,但目前尚无大菱鲆抗无乳链球菌的疫苗研究报道。疫苗是预防链球菌病的有效手段。然而,无乳链球菌共有10种血清型,灭活疫苗特异性强,针对某一血清型制备的灭活疫苗对异种血清型菌株无交叉免疫作用,故使用范围受到极大限制;减毒活疫苗也存在安全性和免疫效力等问题,因此寻求安全、稳定、高效的无乳链球菌疫苗已成为人类医学、畜牧业和水产养殖业共同关注的焦点,对人类健康、经济发展和公共安全具有重要意义。已有学者利用生物信息学方法比对分析人、牛和鱼源无乳链球菌基因组,预测出了一些高度保守、可作为疫苗靶标的抗原蛋白,多是未进行功能分析和命名的新蛋白。相对于其它种类蛋白,细菌表面蛋白,具有暴露充分、数量众多、与抗体接近更容易、能够诱导更高水平免疫反应等特点,是研发预防该疾病的最佳疫苗候选目标之一。本研究选取了3个被预测为具有免疫功能的无乳链球菌细胞表面蛋白,对其基因序列进行生物信息学分析,克隆罗非鱼源无乳链球菌3个蛋白的抗原表位区域,利用基因工程技术进行表达和纯化,分别建立以3个重组蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,并用3个重组蛋白制成的亚单位疫苗对奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)和大菱鲆进行免疫保护性的研究。具体研究内容及结果如下:1.利用生物信息学原理分别分析、预测了Gen Bank公布的人源无乳链球菌2个细胞壁表面锚定蛋白(cell wall surface anchored protein)基因序列(Gen Bank序列号:CP000114.1,SAK_1503、SAK_0896)和1个脂蛋白(lipoprotein)基因序列(Gen Bank序列号:CP000114.1,SAK_0321)的Bepipred线性表位、抗原性、β-Turn、表面可及性、柔韧性和亲水性区域,综合以上参数确定3个细胞表面蛋白的B细胞抗原表位区域分别为29-183 aa、113-457 aa和31-144 aa区间,以此设计特异性引物,克隆罗非鱼源无乳链球菌BX2012分离株3个细胞表面蛋白的目的片段,成功构建的p ET-32a-CWSAP465、p ET-32a-CWSAP1035和p ET-32a-LIP342原核表达载体(Gen Bank序列号:KU759322、KU759323和KU759324),经IPTG诱导后,在BL21(DE3)感受态细胞中实现了可溶性表达,分别获得了分子量约为36、54和30 k Da的蛋白。蛋白经His-Trap FF亲和层析柱纯化,得到的CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白纯度分别由52.89%、36.40%和41.75%提高到94.25%、58.61%和87.23%。Western blotting结果表明,上述3个蛋白可被兔抗无乳链球菌高免血清特异性识别,具有较好的免疫反应原性。2.与Gen Bank中相似序列分析比对结果显示,CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白序列在目前所有已知的不同物种(人、牛、骆驼和罗非鱼)或不同血清型(Ia、II、III、IV和V)无乳链球菌分离株中的同源性分别为96.13%-100%、99.13%-100%和90.35%-100%;在罗非鱼源无乳链球菌分离株中,CWSAP465同源性为98.06%-100%,CWSAP1035为99.71%-100%,LIP342则为100%,证明3个蛋白都是高度保守的。推测除罗非鱼以外,这3个蛋白对其他易感染无乳链球菌的鱼类和牛等哺乳动物甚至是人类也可能具有相似或相同的免疫保护功能。3.分别建立了以CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经反应条件优化,确定CWSAP465和LIP342最适包被浓度为10 ng/μL,CWSAP1035的最适包被浓度为15 ng/μL,血清最佳稀释倍数均为1:40;CWSAP465和CWSAP1035最佳封闭液为10%牛血清,LIP342最佳封闭液为5%BSA;最佳封闭时间均为0.5 h;最佳抗体孵育时间均为0.5 h;CWSAP465和CWSAP1035最佳底物作用时间为10 min,LIP342最佳底物作用时间为5min。CWSAP465-ELISA、CWSAP1035-ELISA和LIP342-ELISA方法的临界值分别为0.243、0.309和0.288。特异性检验结果显示所建立的ELISA方法对迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)罗非鱼阳性血清、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)罗非鱼阳性血清、温和气单胞菌(A.sobria)罗非鱼阳性血清以及猪链球菌2型(S.suis type 2)阳性血清呈阴性反应。重复性试验结果显示,3个ELISA方法板内变异系数介于0.29%-5.33%之间,板间变异系数介于0.96%-7.13%之间,批间变异系数介于0.35%-8.91%之间。建立的CWSAP465-ELISA、CWSAP1035-ELISA和LIP342-ELISA方法具有良好的特异性和重复性,可为Ia血清型无乳链球菌疫苗抗体水平的检验和Ia血清型无乳链球菌流行病学的调查提供参考。4.纯化后的CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白分别以弗氏不完全佐剂制备成亚单位疫苗以检验对奥利亚罗非鱼和大菱鲆的免疫保护效果,设5个试验组和3个对照组,试验组分别为CWSAP465免疫组、CWSAP1035免疫组、LIP342免疫组、CWSAP465+CWSAP1035免疫组(2个CWSAP重组蛋白等比混合免疫组)、CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫组(3个重组蛋白等比混合免疫组),对照组分别为灭活疫苗对照组、PBS对照组和阴性对照组。免疫方式为一次性胸腔注射,注射剂量均为4μL/g鱼体重,即重组蛋白免疫剂量为2μg/g鱼体重。分别在奥利亚罗非鱼和大菱鲆免疫后第0、7、14、21、28、35、42 d采集血清,用所建立的ELISA方法检测抗体水平。结果表明,接受免疫的奥利亚罗非鱼(42±8.52 g)和大菱鲆(64±10.38 g)均能显著提高抗体水平(P0.05),并显著高于灭活疫苗对照组(P0.05),抗体水平在免疫后第四周达到峰值,随后因攻毒而下降。5.免疫后的第28 d进行无乳链球菌攻毒试验,结果显示,接受CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白5个试验组和灭活疫苗免疫后的奥利亚罗非鱼和大菱鲆可有效抵御1×109 cfu/m L的无乳链球菌强毒攻击(P0.05)。Kaplan-Meier生存检验结果显示,CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫组和CWSAP465+CWSAP1035免疫组奥利亚罗非鱼累积生存率显著高于灭活疫苗对照组(P0.05),CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫组大菱鲆的累积生存率显著高于灭活疫苗对照组(P0.05)。CWSAP465+CWSAP1035+LIP342免疫组对奥利亚罗非鱼和大菱鲆的相对保护率(Relative percentage survival,RPS)均显著高于灭活疫苗对照组(P0.05),CWSAP465免疫组、CWSAP1035免疫组、LIP342免疫组和CWSAP465+CWSAP1035免疫组虽与灭活疫苗对照组RPS差异不显著(P0.05),但亦高于灭活疫苗。因此,由3个重组蛋白等比混合制备的疫苗免疫保护效果最为出色。综上所述,本研究在原核表达系统截短表达了罗非鱼源无乳链球菌3个细胞表面蛋白,分别建立了以CWSAP465、CWSAP1035和LIP342蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,并评估了CWSAP465、CWSAP1035和LIP342作为候选疫苗的免疫保护能力。以上述3个重组蛋白制备的亚单位疫苗均可比灭活疫苗更为显著地提高被接种的奥利亚罗非鱼和大菱鲆的抗体水平,并可抵抗高毒力的无乳链球菌攻击,证明3个细胞表面蛋白可作为无乳链球菌全菌灭活疫苗的替代品候选因子。本研究填补了大菱鲆无乳链球菌疫苗研究的空白,首次证明无乳链球菌亚单位疫苗和全菌灭活疫苗对大菱鲆具有免疫保护作用;更填补了这3个细胞表面蛋白在免疫保护方面的研究空白,为今后结构与功能研究奠定了基础,并证明了CWSAP465、CWSAP1035和LIP342是十分具有潜力的预防无乳链球菌病的候选因子,可尝试作为疫苗广泛应用于鱼类无乳链球菌病的预防。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943
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本文编号：1284832