土壤枝孢菌的分离鉴定及极端木聚糖酶的功能验证

发布时间：2017-12-14 08:12

  本文关键词：土壤枝孢菌的分离鉴定及极端木聚糖酶的功能验证

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【摘要】：半纤维素是植物细胞壁的主要成分之一,分离半纤维素高效降解菌株,开发具有应用潜力的新型木聚糖降解酶具有重要意义。本论文从新疆、青海、云南高原土壤中分离获得17株枝孢菌(Cladosporium)。通过基因型(I~TS,AC~T和~TEF1)和表现型的分析,确定了 6个枝孢菌新种Cladosporium neopsychrotolerans SL-16~T(= CGMCC 3.18031~T)、C.paralimoniforme XJ4974~T(=CGMCC 3.18104~T)、C.prolongatum XJ5436~T(= CGMCC 3.18036~T)、C.sinuatum QH1-5~T(= CGMCC 3.18096~T)、C.tianshanenC.SL-14~T(= CGMCC 3.18033~T)和C.verruculosum QH1-6~T(= CGMCC 3.18099~T),极大丰富了枝孢菌种类,首次揭示了土壤是枝孢菌的重要生态位。来源于新疆天山雪莲根际土的嗜冷C.tianshanenC.SL-14和耐冷C.neopsychrotolerans SL-16具有显著的木质纤维素降解能力。为挖掘新颖的极端木聚糖酶基因,对菌株SL-14和SL-16进行了全基因组测序。菌株SL-14和SL-16的基因组分别为33.8 Mb和35.9 Mb,含有9,826个和13,456个基因,编码8,002和11,684个功能蛋白。与嗜冷菌SL-14相比,耐冷菌SL-16含有更多的膜蛋白(967:518)和碳水化合物活性酶(571:408),且更多的碳水化合物活性酶参与植物细胞壁和木聚糖的降解(分别为235:215和46:19),从而在进化上体现了适应极端环境的优势并在新酶挖掘上具有重要价值。根据耐冷C.neopsychrotolernas SL-16的基因组分析结果,确定了一个木聚糖降解酶系,包括四个GH10木聚糖酶、一个GH11木聚糖酶和两个GH43木糖苷酶。基于定量PCR的基因表达水平分析,选取各家族表达水平最高的基因进行基因克隆和大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)表达。重组Xyn1OA、Xyn11A、Xy143A都具有低温酶的特性,最适温度为35-40℃且热不稳定(40℃)。三酶底物特异性宽泛,具有很好的协同效果,同时或依次添加释放的木糖量是单独添加的总木糖量的15.32倍。在中性低温条件下(pH 6.5 and 30℃),添加商业纤维素酶Neutral Max和Xyn11A→Xyn10A→Xy143A可以显著提高玉米秸秆的糖化效率,促进葡萄糖和木糖的生成(1.47倍和11.81倍)。通过去除木聚糖的物理屏障并将其转化成可发酵的木糖,该低温木聚糖降解酶系在生物燃料的节能、环保、高效生产上具有巨大的应用潜力。为获得用于生产益生元木寡糖的木聚糖酶,从嗜热真菌Mycothermus thermophilus CGMCC3.18119中克隆获得四个GH11木聚糖酶编码基因Mtxyn11A、Mtxyn11At、Mtxyn11B和Mtxyn11C,并成功在毕氏酵母Pichia pastoris GS115表达。四个重组酶具有高温(65℃)和中性(pH 6.5-7.0)的酶学性质以及很强的木聚糖降解能力(95.0-96.6%)。为了测定木寡糖对益生菌的促生长作用,以不同木聚糖酶的水解产物为唯一碳源,培养乳酸杆菌Lactobacillus brevis、L.rhamnosus.casei和L.plantarum。结果表明四株乳酸菌可以利用83.8-98.2%的木聚糖酶水解产物。MtXyn11A因高产率、高比活、高催化效率、高底物转化率、所产的木寡糖促乳酸杆菌快速生长的优点,在生产和应用方面具有重大的潜力。本研究首次报道了土壤来源的六个枝孢菌新种,完成了两株低温枝孢菌的全基因组测序和比较基因组学分析,并验证了一个低温木聚糖降解酶系在降解木聚糖和木质纤维素中的协同作用以及四个高温木聚糖酶用于生产益生元木寡糖的潜力,为挖掘木聚糖酶的适温机制提供了宝贵的研究材料,在工业酶的基础和应用研究中具有重要的意义。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S154

【参考文献】

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1 王强;范雪荣;高卫东;陈坚;;棉针织物复合生物酶精练加工[J];纺织学报;2006年07期

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本文编号：1287165