薄皮甜瓜脂氧合酶CmLOX10和CmLOX13的原核表达、生化特性及启动子分析

发布时间：2017-12-14 11:02

  本文关键词：薄皮甜瓜脂氧合酶CmLOX10和CmLOX13的原核表达、生化特性及启动子分析

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【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var. makuwa Makino)是一种重要的经济作物,在中国和东亚国家广泛种植,和厚皮甜瓜比较,其主要特点是植株抗逆性和抗病性较差。前人研究发现经过脂氧合酶(LOX)途径可以产生茉莉酸类物质(JAs)和绿叶挥发性物质(GLVs),它们普遍被认为是植物中调控防御相关基因表达的关键调控因子,因此研究LOX基因的功能可为通过基因工程提高薄皮甜瓜抗逆性提供一定的理论基础。尽管最近几十年来越来越多的植物中发现了新的LOX基因,但是对于薄皮甜瓜中LOXs基因的研究较少。随着甜瓜基因组测序的完成,为薄皮甜瓜的LOX基因的克隆和功能分析提供了便利。在先前的研究中,从甜瓜基因组数据库中搜索到18个LOX基因并分别命名为CmLOX01～CmLOX18,通过与其他植物中已鉴定的LOXs构建系统进化树后发现,CmLOX10和CmLOX13在系统进化树中聚在一起且它们之间的氨基酸序列相似性较高,为58.11%。为了验证薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的基因功能,以薄皮甜瓜‘玉美人’为材料进行研究,主要研究结果如下：1.通过RT-PCR和5'RACE技术相结合的方法,获得了薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13基因的全长序列。CmLOX10 (GenBank:KT613843)的ORF长度为2709 bp,5’UTR和3’UTR的长度分别为47和118 bp。CmLOX10基因编码902个氨基酸,分子质量为102.301 kDa,等电点为6.0。CmLOX13 (GenBank:KT613844)的ORF长度为2721bp,5'UTR和3’UTR的长度分别为48和21 bp。CmLOX13基因编码906个氨基酸,分子质量为102.312 kDa,等电点为6.34。通过序列比对发现,薄皮甜瓜CmLOX10与甜瓜基因组数据库中GeLOX10有7个核苷酸和3个氨基酸的不同,而薄皮甜瓜CmLOX13与甜瓜基因组数据库中GeLOX13有5个核苷酸和1个氨基酸的不同。2.使用多种生物信息学软件对薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的氨基酸序列进行分析,结果表明CmLOX10和CmLOX13都含有PLAT和LOX保守结构域,并且都含有叶绿体转运肽,分别为37和23个氨基酸。通过CmLOX10和CmLOX13氨基酸序列比对,发现了许多与LOX蛋白功能相关的保守结构域和氨基酸,并据此预测这两个蛋白都为13-LOXs。3.以薄皮甜瓜嫩叶DNA为模板,通过PCR技术获得了CmLOX10和CmLOX13启动子序列,其长度分别为2155 bp和2097 bp。通过序列比对,CmLOX13和GeLOX13启动子序列之间的相似度为98.72%,而CmLOX10和GeLOX10启动子序列之间的相似度却只有93.19%。使用PlantCARE和PLACE数据库对扩增获得的CmLOX10和CmLOX13启动子中可能存在的顺式作用元件进行了分析,发现了许多与激素和环境胁迫相关的顺式作用元件,如与SA响应相关的TCA-element元件,与生长素响应相关的TGA-element元件,与GA响应相关的GAREAT元件以及与创伤响应相关的WUN-motif元件。4.通过薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的原核表达获得CmLOX10和CmLOX13重组蛋白,依次经过蛋白纯化、SDS-PAGE鉴定、Western-blot鉴定和蛋白浓缩而获得CmLOX10和CmLOX13纯化蛋白。对最后得到的纯化蛋白进行酶活力分析表明,CmLOX10和CmLOX13的最适pH值分别为5.0和5.5,最适温度分别为45℃和35℃;对CmLOX10和CmLOX13进行动力学参数分析表明,亚油酸是它们的最适底物；通过高效液相色谱(HPLC)法对CmLOX10和CmLOX13与亚油酸反应后的底物的进行分析表明,它们都是13-LOXs。5.使用Gateway法构建CmLOX10和CmLOX13的过表达载体,转入农杆菌GV3101中,通过在烟草叶片中瞬时表达的方法,观察CmLOX10和CmLOX13蛋白的亚细胞定位。试验结果表明,CmLOX13蛋白的亚细胞定位与使用软件预测的即定位在叶绿体的结果一致,而CmLOX10蛋白定位在细胞膜上,与软件预测的结果不同。6.通过PlantCARE和PLACE数据库对CmLOX10和CmLOX13启动子序列进行分析后,构建薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13 5'缺失启动子植物表达载体。将CmLOX135’缺失启动子在烟草叶片中瞬时表达后,对烟草叶片进行激素和非生物胁迫处理,对处理后的烟草叶片经GUS组织化学染色和荧光定量分析表明p121GUS:13-5结构的GUS活性明显高于其它的5’缺失结构并且CmLOX13启动子对除乙烯处理之外的ABA、SA、 GA、IAA、MeJA、创伤、冷害和高温处理都是有响应的。7.将构建的CmLOX10和CmLOX13过表达载体通过花序浸润法转化拟南芥植株,最终经过0.0005%除草剂Basta和RT-PCR鉴定筛选到了T1代转基因植株,为进一步鉴定薄皮甜瓜CmLOX10和CmLOX13的基因功能提供了材料。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S652

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1287633