大豆低丰度蛋白的分离、鉴定及其提取物对小鼠的生理效应研究

发布时间：2017-12-15 10:21

  本文关键词：大豆低丰度蛋白的分离、鉴定及其提取物对小鼠的生理效应研究

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【摘要】：在大豆中表达量较少的大豆低丰度蛋白,因受传统提取方法的限制及检测时高丰度蛋白的遮蔽作用,使其提取及鉴定成为大豆蛋白质组学研究的一大挑战。因此,本研究对大豆低丰度蛋白的提取方法进了优化,并试图在鉴定提取物成分的基础上揭示大豆低丰度蛋白提取物对断奶小鼠的生理功能效应(无大豆高丰度蛋白干扰)。1大豆低丰度蛋白的分离、鉴定本研究探究了异丙醇浓度、超声功率、超声时间和总提取时间等因素对大豆低丰度蛋白分离的影响,优化了其提取条件,并对最佳条件下的提取物成分通过SDS-PAGE、MS及液相、气相色谱等方法进行了鉴定。结果显示：(1)50%异丙醇去除大豆高丰度蛋白的效果较好,超声功率400 W、超声10 min和提取1h(超声时间+水浴震荡)分别是大豆低丰度蛋白的最佳提取单因素条件,且超声处理的作用远大于总提取时间的。(2)大豆低丰度蛋白提取、富集的最佳条件为：50%异丙醇,超声功率350 W,超声15 min,提取1 h。(3)大豆低丰度蛋白提取物中检测到一些无法通过常规提取法获得的低丰度蛋白如磷酸酯-D、β-淀粉酶、16.5 KD油质蛋白、无特征大豆蛋白和未知大豆蛋白,且无高丰度蛋白(大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白)和大豆异黄酮,而异丙醇和丙酮的残留量分别仅为0.0231%和0.0430%。2大豆低丰度蛋白提取物(以下简称提取物)对小鼠生长性能的影响选用180只21日龄ICR断奶小鼠,分成5组(对照和Do.5mg, D1mg,D2mg,D4mg等4个处理组,mg代表灌胃液中的低丰度蛋白量),每组3个重复。饲喂AIN93G标准化小鼠纯合日粮1周以适应环境,28日龄开始灌胃试验,探究不同剂量提取物对小鼠生长性能的影响。结果显示：(1)各试验期处理组小鼠的体重均高于其对照,且D2mg组最高。(2)除1-7 d外,其他试验期处理组小鼠的日增重、肉料比和增长率均高于其对照,且D2mg组最高。(3)7 d时,E组小鼠心脏指数显著低于对照妒0.05)；28 d时,处理组小鼠心脏、肾脏指数均高于对照。综上所述,大豆低丰度蛋白提取物在1-7 d时对小鼠生长有一定抑制作用；随着试验期的延长,提取物表现出明显的促生长效果,且以D2mg组的效果最佳。3提取物对小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响本试验旨在研究提取物对小鼠免疫功能和抗氧化能力的影响,试验动物及分组等同上。结果显示：(1)7、14、21 d时的D2mg、D4mg组小鼠血清白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数目均高于对照,且E组最高。(2)7、28 d时,各试验组小鼠胸腺指数均无显著差异,但各试验期D2mg组均低于对照；7、14、21 d时的处理组小鼠脾脏指数与其对照差异不显著,其中各试验期D4mg组均高于对照；7、14、21 d时处理组的肝脏指数低于对照,28 d时均高于对照。(3)各试验期D2mg组小鼠血清IL-2含量高于对照；7、28 d时各试验处理组的IL-10、IgG和TNF-α含量与对照相比无显著差异,且28 d时的D2mg组IL-2、 IgG口]NF-α含量高于其他组；7、28 d(D2mg组除外)时,各试验处理组小鼠脾脏的IL-2、 TNF-α基因相对表达量均高于对照；28 d时各试验组间的His、D-乳酸含量无显著差异,但D2mg组均低于对照,而7 d时高于其对照。(4)28 d时各试验处理组小鼠血清的T-AOC含量均高于对照,各试验期Dlmg、D2mg组小鼠血清T-AOC含量高于对照；7 d时各试验组小鼠肝脏的SOD、CAT和GPX基因相对表达量差异不显著,28 d时的Dlmg、D2mg组高于对照。以上结果表明：7 d时,灌胃提取物使小鼠的机体发生了免疫反应,导致其肠道一定程度受损,但对小鼠抗氧化能力无显著影响。4提取物对小鼠消化代谢相关血液指标和基因表达的影响本试验探究了提取物对小鼠消化代谢的影响,试验动物及分组等同上。结果显示：(1)28 d时各试验组小鼠血清的TC和TG含量无显著差异,且D 2mg组最低；7、14 d各试验处理组小鼠血清的Apo-B含量均高于其对照,21、28 d各试验处理组均低于其对照(28 d时D0 5mg组除外)；7 d时D2mg组小鼠肝脏HMG-CoA、ACS、SREBP-1c和SREBP-2基因相对表达量均低于其他各处理组,28 d时D21ng组小鼠肝脏HMG-CoA、ACS在所有试验组中最高,而D4mg组SREBP-1c和SREBP-2最高。(2)7、14、21d各试验组血清GLU含量无显著差异,28 d时各试验处理组均高于对照；各试验期D1mg、D2mg组小鼠血清胰岛素水平较高,D4mg组低于对照；7 d时D0.5mg、D1mg组小鼠肝脏PEPCK、GCK基因相对表达量较高,而D2mg、D4mg组较低；28 d时在所有试验组中,D4mg组PEPCK最低但GCK最高。(3)28 d时的处理组小鼠血清ALB、GLB含量和A/G与对照无显著差异,7 d时的处理组小鼠血清ALB含量与对照无显著差异,GLB含量高于对照而A/G低于对照；7 d时的处理组小鼠肝脏ALB基因相对表达量均高于其对照,28 d时的D4mg组低于其他各试验组。7d时的处理组小鼠血清ALT含量均低于其对照,21、28 d(D0.5mg组ALT除外)均高于其对照。总之,提取物通过对小鼠血清胰岛素水平、肝脏代谢基因HMG-CoA.ALB和PEPCK表达量等影响改变了小鼠机体糖、脂、蛋白质的消化代谢,且尤以D2mg组最为明显。5提取物对小鼠小肠微生物菌群的影响本试验通过高通量测序法研究了不同剂量灌胃提取物小鼠的小肠细菌群落结构多样性和组间相似性。结果表明：(1)适量(D0.5mg、D1mg、D2mg组)提取物改变了小鼠肠道的微生物区系,提高了小鼠小肠内的微生物丰富度,增加了微生物的多样性。(2)在门的水平上,厚壁菌门(83.15% -91.96%)、蓝菌门、放线菌门、变形菌门和拟杆菌门为优势菌门；在属的水平上,链球菌属、芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、乳酸球菌属、Allobaculum、Chloroplast等为优势菌属。(3)试验D2mg组乳酸菌(乳酸杆菌和乳酸球菌之和)属所占比例最高,比对照提高25.11%,其中乳酸杆菌属所占比例显著高于D0.5mg、D4mg(P0.05)。(4)各试验组共享1620个OTU,占细菌总OTU数目的10.53%；Unifrac主坐标分析结集也表明不同试验组小肠微生物群落结构存在一定差异,且同组个体之间也具有较大差异。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816

【参考文献】

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本文编号：1291632