鸡白痢沙门氏菌优势抗原细菌铁蛋白诱导产生IFN-β的分子机理

发布时间：2017-12-16 23:20

  本文关键词：鸡白痢沙门氏菌优势抗原细菌铁蛋白诱导产生IFN-β的分子机理

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【摘要】：鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)主要侵害2-3周龄以内的幼雏,引起白色下痢,病死率高。成年鸡感染后,虽然不会出现典型的临床症状,但长期处于带菌状态,可以水平和垂直传播病菌,对养禽业造成极大的危害,同时也危害公共卫生安全。目前在西方发达国家该病已经被净化,而我国鸡白痢仍然时常发生。目前除了淘汰感染鸡仍然没有有效的控制措施。同时,鸡白痢沙门氏菌的致病机理仍不清楚。IFN-β在先天性免疫防御过程中扮演着非常重要的角色,包括抗病毒和胞内寄生菌感染以及引起细胞凋亡。本研究筛选到了鸡白痢沙门氏菌优势抗原细菌铁蛋白,并对该细菌铁蛋白诱导IFN-β表达的分子机理进行了研究,为揭示沙门氏菌的致病机理提供参考。利用免疫沉淀技术(pull-down)筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原,通过质谱与生物信息学分析,获得细菌铁蛋白(bacterioferritin, Bfr)、热休克蛋白60 (GroEL)、乙醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase E, AdhE)等优势抗原,借助分子生物学技术将bfr基因克隆到原核表达载体pET28a (+)以及pGEX-6P-1上,经过诱导表达与纯化得到具有摄取铁功能的重组蛋白His-Bfr和GST-Bfr。以纯化的His-Bfr免疫BALB/c小鼠,经细胞融合,并以纯化的GST-Bfr进行ELISA筛选,经过三次亚克隆最后获得了三株能够稳定分泌针对Bfr蛋白单抗的杂交瘤细胞系。通过对这三株单抗进行鉴定,确定这三株单抗的亚类均为IgG1,识别相同的抗原表位,同时具备高亲和力、特异性强等特点。由于沙门氏菌可侵入细胞内存活和增殖,为进一步分析鸡白痢沙门氏菌Bfr蛋白在宿主细胞内的生物学作用,我们构建了pEGFP-byr质粒,并以该质粒转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)。结果表明,过表达Bfr蛋白明显上调IFN-β表达。通过对Bfr蛋白氨基酸区域分析发现,Bfr蛋白分子的1-50位氨基酸对诱导IFN-β上调表达起着关键作用。为进一步分析Bfr蛋白诱导IFN-β产生的信号通路,我们分别以p38抑制剂和JNK抑制剂作用于DF-1细胞,观察其对Bfr诱导IFN-β的影响。结果表明,p38抑制剂显著抑制Bfr蛋白引起的IFN-β上调表达,同时过表达Bfr蛋白能诱导DF-1细胞内的p38蛋白发生磷酸化。然而JNK抑制剂对Bfr诱导的IFN-β没有影响。该实验结果说明Bfr蛋白通过p38信号转导通路诱导IFN-β产生。为进一步分析Bfr在鸡白痢沙门氏菌感染宿主细胞中的作用,我们通过λ-Red同源重组系统以野生型鸡白痢沙门氏菌(WT)制备了bfr基因缺失株(KO)以及回补株(RS),并以之感染DF-1细胞。结果发现,缺失株引起的IFN-β表达水平较野生株、回补株显著降低,说明Bfr在鸡白痢沙门氏菌诱导IFN-β表达中发挥重要作用。为进一步分析Bfr蛋白在细胞中的作用,我们以流式细胞术检测Bfr对细胞凋亡的影响,结果发现在DF-1细胞中过表达Bfr蛋白明显引起细胞凋亡,进一步在HEK 293T细胞和Hela细胞中验证了Bfr蛋白引起的细胞凋亡与其诱导表达IFN-β有关。以上结果,说明鸡白痢沙门氏菌优势抗原Bfr通过激活p38信号通路诱导IFN-β表达。同时,利用鸡白痢沙门氏菌野生株、bfr基因缺失株及回补株感染吞噬细胞,发现Bfr可以明显抑制吞噬细胞的吞噬、清除功能以及IL-12、TNF-α产生。综上所述,本研究利用免疫沉淀技术筛选到了鸡白痢沙门氏菌的三个优势抗原Bfr、GroEL、 AdhE,研究发现Bfr蛋白可以通过激活p38 MAPK信号通路诱导IFN-β表达。这些研究结果为建立鸡白痢检测试剂盒奠定基础,同时为阐述鸡白痢沙门氏菌的致病机理提供了重要的科学参考。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

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本文编号：1297863