小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素抗性的分子机制研究

发布时间：2017-12-17 07:26

  本文关键词：小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素抗性的分子机制研究

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【摘要】：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)属于革兰氏阳性昆虫病原微生物,由于其高效安全,Bt制剂已经成为世界上用量最大的微生物杀虫剂。Bt在产孢过程中产生的Cry类杀虫晶体蛋白基因也已被转入到多种重要的粮棉作物(Bt作物)中用于田间害虫防治,在世界农业生产中发挥了重要的作用。然而,Bt制剂大量和不合理使用以及Bt作物的大面积种植不可避免的导致田间害虫的Bt抗性进化。而对昆虫Bt抗性机制认识的不足,正严重制约着Bt抗性治理和新型Bt杀虫蛋白的开发与应用,并严重威胁着转Bt基因作物的使用寿命。因此,考虑到Bt生物杀虫剂的经济和环境重要性,阐明昆虫Bt抗性分子机制对于延缓田间害虫Bt抗性进化和Bt的可持续应用具有重要的意义。小菜蛾(Plutella xylostella)是一种世界性分布的十字花科作物重要害虫,它能快速对各种杀虫剂形成抗药性,每年能在世界范围内引起40 50亿美元的巨大经济损失。而且,小菜蛾是第一个在田间被报道对Bt喷洒制剂产生抗性的害虫。因此,小菜蛾已成为研究复杂的Bt抗性分子机制的模式昆虫,特别是在最近其全基因组测序完成并公开后,这点表现的尤为明显。尽管近年来研究发现小菜蛾Bt Cry1Ac抗性与Bt R-1抗性基因座内一个ABC转运蛋白基因(Px ABCC2)的基因突变有关,但是对小菜蛾Bt Cry1Ac抗性的分子机制的全面理解仍然任重而道远。在本论文中,我们以多个小菜蛾Bt敏感和Bt Cry1Ac毒素/Btk制剂抗性种群为研究对象,通过一系列昆虫毒理学、昆虫生理学、分子生物学、生物化学、分子遗传学和生物信息学等技术和方法对小菜蛾Bt Cry1Ac抗性分子机制进行了深入研究。研究结果表明,小菜蛾Bt Cry1Ac抗性与中肠钙粘蛋白基因(Px CAD)和中肠ABC转运蛋白基因(Px ABCH1)无关,而是与Bt R-1抗性基因座内有丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)信号途径上游转录激活的Px MAP4K4基因反式调控Bt R-1抗性基因座外的中肠膜结合形式的碱性磷酸酶基因(Pxm ALP)和中肠ABC转运蛋白基因(Px ABCG1)以及Bt R-1抗性基因座内的ABC转运蛋白基因(Px ABCC1-3)的差异表达密切相关。本研究结果对新型Bt作物的研发、害虫对Bt作物/Bt制剂抗性的田间检测与综合治理、新型Bt杀虫蛋白的开发与可持续应用均有重要的理论和实践意义。主要研究内容和结论如下:一、小菜蛾的室内饲养、抗性汰选与毒力生物测定利用实验室良好的昆虫饲养条件以及独特的甘蓝萝卜苗法形成了一整套成熟标准的小菜蛾室内大规模人工隔离饲养技术,同时,形成了标准的小菜蛾幼虫Bt抗性汰选和毒力生物测定方法。毒力生物测定结果显示,与Bt敏感小菜蛾种群相比,所有4个抗性小菜蛾种群对Bt Cry1Ac毒素/Btk制剂均形成了较高的抗性水平,为后续功能实验的开展提供了良好的供试虫源。二、Bt Cry1Ac毒素与小菜蛾中肠BBMV蛋白结合分析利用Western Blot技术对Bt Cry1Ac活化毒素与小菜蛾中肠BBMV蛋白的结合情况进行半定量分析,结果表明,所有Bt抗性小菜蛾种群中肠BBMV与Cry1Ac活化毒素的结合水平显著性降低,这表明这些Bt抗性小菜蛾种群的中肠受体发生变化(受体基因突变或表达量改变)是其对Bt产生抗性的主要分子机制。三、小菜蛾中肠CAD基因与Bt抗性的关系研究通过对小菜蛾Bt敏抗种群中肠Px CAD基因的全长c DNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现,该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后,利用实时荧光定量PCR(q PCR)技术对Px CAD基因表达量进行分析后发现,小菜蛾Bt敏抗种群间该基因的转录水平并没有显著性差异。RNA干扰(RNAi)实验结果表明Px CAD基因表达量降低并不影响小菜蛾敏感种群幼虫对Cry1Ac毒素的敏感性。而且,遗传连锁实验证实Px CAD基因与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状并不连锁。因此,小菜蛾中肠Px CAD基因与Bt Cry1Ac抗性分子机制无关。四、小菜蛾中肠ALP基因与Bt抗性关系的研究测定小菜蛾Bt敏抗种群的中肠BBMV样品中ALP和APN的酶活力后结果显示,与Bt敏感小菜蛾种群相比,所有Bt抗性的小菜蛾中肠BBMV样品中ALP酶活力均显著性降低,而APN的酶活力没有显著性变化,这表明小菜蛾中肠ALP基因可能与小菜蛾Bt抗性相关。随后,利用RACE技术克隆了小菜蛾中肠膜结合形式的ALP基因(Pxm ALP)的全长c DNA序列。序列比对分析发现,小菜蛾敏抗种群间Pxm ALP基因序列并无稳定的突变位点。q PCR结果显示,与Bt敏感种群相比,所有小菜蛾Bt抗性种群的Pxm ALP基因在中肠组织中转录水平显著性降低。利用ELISA、免疫荧光定位和细胞毒性测定实验证实了Sf9细胞重组表达的Pxm ALP蛋白可以作为Bt Cry1Ac毒素的功能性受体。RNAi实验结果表明Pxm ALP基因表达量降低可以导致小菜蛾幼虫对Cry1Ac毒素的敏感性显著性降低。而且,遗传连锁实验证实Pxm ALP基因中肠表达量降低与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状紧密连锁。因此,小菜蛾中肠Pxm ALP基因表达量降低与Bt Cry1Ac抗性分子机制密切相关。五、小菜蛾中肠ABCC1-5基因与Bt抗性关系的研究利用遗传连锁图谱定位数据、小菜蛾和家蚕全基因组数据以及小菜蛾和家蚕基因之间的遗传共线性关系成功组装了3.15Mb大小的Bt R-1抗性基因座。生物信息学分析发现,Bt R-1抗性基因座内含有5个ABC转运蛋白基因(Px ABCC1-5)。在小菜蛾Bt敏抗种群中对Px ABCC1-5基因的全长c DNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现,这5个基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后,q PCR实验结果显示,与小菜蛾Bt敏感种群相比,小菜蛾Bt抗性种群中肠Px ABCC2和Px ABCC3基因的转录水平显著性降低,而中肠Px ABCC1基因的转录水平显著性升高。利用RNAi沉默中肠Px ABCC2和Px ABCC3基因的表达量后能显著降低小菜蛾敏感种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性,而组合干扰Pxm ALP、Px ABCC2和Px ABCC3基因的表达量后能进一步降低其敏感性。更重要的是,遗传连锁实验证实Px ABCC2和Px ABCC3基因表达量降低与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状紧密连锁,然而Px ABCC1基因表达量升高与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状并不连锁。因此,小菜蛾中肠Px ABCC2和Px ABCC3基因表达量降低与Bt Cry1Ac抗性分子机制密切相关。六、小菜蛾中肠MAP4K4基因与Bt抗性关系的研究生物信息学分析后发现,Bt R-1抗性基因座内还具有3个MAPK信号途径基因,其中,Px MAP4K4基因位于MAPK信号途径上游且紧邻Px ABCC1-3基因。在小菜蛾Bt敏抗种群中对该基因的全长c DNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现,该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后,q PCR实验结果显示,与小菜蛾Bt敏感种群相比,小菜蛾Bt抗性种群间中肠Px MAP4K4基因的转录水平升高,表明该基因在小菜蛾Bt抗性种群中转录激活。利用RNAi沉默小菜蛾抗性种群的中肠Px MAP4K4基因的表达量后能导致Pxm ALP、Px ABCC2和Px ABCC3基因的表达量显著性升高以及Px ABCC1基因的表达量显著性降低并最终重建小菜蛾抗性种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此,小菜蛾MAPK信号途径上游转录激活的Px MAP4K4基因能反式调控Pxm ALP和Px ABCC1-3基因的表达量改变并最终导致小菜蛾对Bt Cry1Ac毒素产生高抗性。七、小菜蛾中肠ABCG1基因与Bt抗性关系的研究对本实验室小菜蛾中肠转录组和RNA-Seq数据进行重新分析后发现一个全新的ABC转运蛋白基因(Px ABCG1或Pxwhite)在Bt抗性小菜蛾种群中表达量显著性降低。随后,在小菜蛾Bt敏抗种群中对该基因的全长c DNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现,该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后,q PCR实验结果显示,与小菜蛾Bt敏感种群相比,小菜蛾Bt抗性种群间中肠Px ABCG1基因的转录水平显著性降低。利用RNAi沉默中肠Px ABCG1基因的表达量后能显著降低小菜蛾敏感种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。而且,遗传连锁实验证实Px ABCG1基因表达量降低与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性性状紧密连锁。因此,小菜蛾中肠Px ABCG1基因表达量降低与Bt Cry1Ac抗性密切相关。八、小菜蛾中肠ABCH1基因与Bt抗性关系的研究对本实验室小菜蛾中肠转录组和RNA-Seq数据进行重新分析后发现了另一个全新的ABC转运蛋白基因(Px ABCH1)在Bt抗性小菜蛾种群中表达量发生变化。在小菜蛾Bt敏抗种群中对该基因的全长c DNA序列进行PCR克隆和序列比对分析后发现,该基因并未在Bt抗性小菜蛾中发生稳定的基因突变。随后,q PCR实验结果显示,在小菜蛾Bt敏抗种群间中肠Px ABCH1基因表达量并无显著性差异。利用低剂量ds RNA进行RNAi沉默中肠Px ABCH1基因的表达量后并不影响小菜蛾敏感种群幼虫对Bt Cry1Ac毒素的敏感性。因此,小菜蛾中肠Px ABCH1基因与Bt Cry1Ac抗性无关。然而,利用高剂量ds RNA进行RNAi沉默中肠Px ABCH1基因的表达量后却能导致小菜蛾Bt敏抗小菜蛾种群在幼虫期和蛹期全部死亡,这表明Px ABCH1基因可以作为基于RNAi害虫防治和抗性治理策略的优秀靶标基因。总之,这些研究发现并鉴定了一系列小菜蛾Bt Cry1Ac抗性相关的关键基因并揭示了一种负责调控这些关键基因表达量的全新反式信号调控分子机制。因此,该研究在国际上首次全面阐明了小菜蛾田间进化Bt Cry1Ac抗性的分子机制。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.4
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本文编号：1299271