逸出介导的艾美耳球虫清除的分子机制的初步研究

发布时间：2017-12-17 12:28

  本文关键词：逸出介导的艾美耳球虫清除的分子机制的初步研究

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【摘要】：顶复门原虫是一类严格的胞内寄生病原,在细胞内的繁殖周期需经过入侵、细胞内增殖及从宿主细胞中逸出三个过程。在上述三个过程中,逸出作为两次胞内周期的连接点对于本门原虫的生存和繁殖具有重要意义。近年来,随着研究的深入,免疫因素介导的顶复门原虫逸出的研究逐步兴起。我研究小组于2011年发现激活后的淋巴细胞在体外可以诱导入侵细胞不久的柔嫩艾美耳球虫子孢子逸出。在此基础上我们提出了免疫因素诱导子孢子逸出可能是机体清除艾美耳球虫的一种有效途径的假说。本研究通过体外及体内实验对艾美耳球虫子孢子逸出的及逸出介导的艾美耳球虫清除的分子机制进行了研究。在研究中我们首先建立了基于流式细胞仪检测艾美耳球虫子孢子逸出水平的体外检测平台,在此基础上对子孢子的逸出机制进行了初步研究。研究结果发现虫体经诱导逸出的能力与其在细胞中的发育程度相关,这为我们在体内研究中选择检测时间点提供了参考；进一步地我们发现钙离子是介导虫体逸出的关键分子,这为我们有的放矢地选择可诱导子孢子逸出的免疫相关分子提供了依据。在寻找可诱导子孢子逸出的免疫相关分子的过程中我们发现一氧化氮可以诱导艾美耳球虫子孢子逸出,这种诱导性逸出没有虫种和宿主细胞特异性,且经诱导逸出的虫体再次入侵细胞的能力和在鸡体内的繁殖能力分别下降了67.2%和52.4%。在上述研究的基础上我们利用一氧化氮诱导宿主细胞中的子孢子逸出,将逸出的子孢子转移到不同浓度的巨噬细胞的培养系统中,最终发现逸出的子孢子很快被巨噬细胞吞噬、杀灭。至此我们初步建立了一个以免疫相关因子诱导子孢子逸出并通过巨噬细胞将其清除的体外模型。该模型的建立为体内研究提供了理论上的依据,模型上的参考。根据前述发现,我们将体内研究的重点集中在经艾美耳球虫免疫的宿主再次感染后,在球虫的子孢子阶段研究宿主免疫系统是否会诱导刚入侵的子孢子逸出,进而将其清除。鉴于体内研究的复杂性,我们首先需要选择一种在动物体内检测逸出发生的可靠手段。我们先后尝试了利用Real-Time PCR方法检测子孢子逸出特异性蛋白的基因表达水平、通过基因组Real-Time PCR方法对系统中子孢子数量进行定性研究、基于组织学技术对子孢子逸出的发生进行研究。我们发现基于组织学技术的检测方法更具有可行性。通过组织切片的橙黄G染色发现免疫攻虫组肠道中的子孢子数量略少于未免疫攻虫组；通过免疫组织化学染色则发现免疫攻虫组的肠道中没有虫体定殖的纳虫空泡的比例高于未免疫攻虫组。上述实验结果提示宿主体内有可能存在逸出介导的艾美耳球虫清除的现象。综上所述,本研究结合体外和体内实验,进一步阐示了逸出介导的艾美耳球虫清除途径存在的可能性。在今后的研究中需要在体内实验中寻找到更加可靠的逸出检测手段,获得更加确实的数据,从而最终证明逸出介导的艾美耳球虫清除途径在宿主免疫系统中的存在
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.7

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本文编号：1300130