捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因组测序及基于转录组分析的捕食相关基因研究

发布时间：2017-12-17 20:18

  本文关键词：捕食性真菌Duddingtonia flagrans全基因组测序及基于转录组分析的捕食相关基因研究

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【摘要】：Duddingtonia flagrans是捕食线虫性真菌的一个代表种类,强大的环境耐受力与捕食线虫能力使它在动物寄生性线虫防治方面具有不可比拟的优势。国内外科学家针对Duddingtonia flagrans做了大量的研究工作,内容贯穿形态学结构观察、生物学特性研究与临床杀虫效果评价。但是由于缺乏分子水平研究基础,直到目前,我们还无法从基因与进化角度说明其对线虫的致病力与生存能力,这可能是制约捕食线虫性真菌研究领域发展的一个重要原因。为此,本研究以捕食线虫性真菌Duddingtonia flagrans为研究对象,在国内外首次对其进行了全基因组测序与转录组测序,通过比较基因组学分析,揭示其基因组特征、腐生能力、致病能力、起源与进化特点;利用转录组学分析,筛选一系列与捕食线虫功能相关的基因,并对其进行荧光定量PCR验证;借助于光学显微镜及扫描电子显微镜,对Duddingtonia flagrans捕食寄生性线虫三期幼虫过程,进行了详尽的观察与描述;利用活体荧光染色技术,对Duddingtonia flagrans原生质体的制备进行了评价,为捕食线虫相关基因的功能验证提供了基础研究材料。主要取得的研究成果有以下几个方面:(1)对D.flagrans基因组DNA提取方法进行了筛选与优化,结果表明透析膜培养结合柱式法提取其基因组DNA的方法简便可行,为丝状真菌DNA提取提供了新的思路;利用低深度二代测序技术,对D.flagrans的基因组概况进行了评估,结果表明D.flagrans基因组大小约为37.6 Mb,GC含量为44.95%,基因组杂合度较低,可以采用常规方法对其进行深度测序与组装,该研究为D.flagrans全基因组精细图谱绘制方案的制定提供了重要依据。(2)在对D.flagrans进行三代高深度测序的基础上,利用比较基因组学分析对D.flagrans基因组特征、腐生能力以及对线虫的致病性进行了分析。结果显示,D.flagrans基因组较小,并且缺乏重复诱导点突变机制,显示了其缓慢的进化速率。同时,同源基因分析和基因家族分析表明D.flagrans基因组变异不明显、保守性较强。致病性分析表明,D.flagrans具有丰富的潜在致病基因,这些基因在线虫捕食过程中发挥重要作用,包括PHI基因,细胞色素P450基因,以及数量众多的蛋白酶编码基因。与之相反,D.flagrans中碳水化合物降解酶基因数量较少,表明D.flagrans利用碳水化合物的能力较弱,反映出D.flagrans较弱的腐生能力。(3)对捕食线虫性真菌D.flagrans捕食马圆线虫属幼虫过程进行了超微形态学观察,进一步深入认识了该真菌与线虫相互作用的过程;通过实时动态观察,将整个捕食过程划分为三个阶段,分别为捕食前(0h)、捕食中(12 h)、捕食后(48 h),不同捕食阶段的划分为后续D.flagrans转录组研究样品采集工作提供了理论依据,也为D.flagrans捕食相关基因的发掘奠定了理论基础。(4)以D.flaagrans基因组为参考,对D.flagrans捕食线虫的不同阶段样本进行转录组测序,结果表明,D.flagrans在捕食线虫过程中,共有41.2%的基因发生差异表达,其中上调表达基因有2877个,下调表达基因有3269个;对差异表达基因进行GO功能富集分析表明,在真菌捕食线虫过程中,参与能量代谢、扩膜转运的相关基因产生了显著表达,这些基因与真菌在捕食线虫时大量分泌胞外蛋白酶以及能量的产生有关;KEGG富集分析表明,上调基因中,次级代谢产物合成途径富集的基因数目最多,说明次级代谢产物在真菌侵染线虫过程中发挥了重要作用;下调基因中淀粉与蔗糖代谢、内质网蛋白质加工、过氧物酶体、碳代谢过程富集的基因数目多,说明与真菌腐生作用相关的碳水化合物降解作用减弱;对捕食过程中分泌蛋白酶调控基因分析与前100位差异表达基因统计分析表明,在真菌捕食线虫时,参与捕食功能的凝集素、几丁质酶、枯草杆菌蛋白酶、G蛋白偶联受体、MAPK信号通路、细胞骨架构建等相关基因等基因高水平表达,而与腐生有关的碳水化合物降解酶基因呈下调表达趋势。(5)以转录组分析中筛选的与捕食线虫功能相关的基因为基础,挑选了其中22种对于捕食功能具有重大意义的目的基因,并进行荧光定量PCR验证,结果显示,11种上调表达基因与11种下调表达基因表达趋势均符合转录组分析所得数据,验证了转录组数据的可靠性,并进一步证明了这些基因参与了D.flagran 捕食线虫过程。(6)为了对筛选的捕食线虫相关基因进行功能验证,为目的基因敲除提供试验材料—D.flagrans原生质体,本研究利用荧光探针CFDASE,对D.flagrans原生质体制备情况进行快速评估,探究了 CFDASE标记原生质体的最佳条件,结果显示,CFDASE终浓度为10μmol/L、标记时间为15 min、孵育温度为36℃为标记最佳条件。该结果为捕食线虫性真菌D.flagrans原生质体的大量制备提供了快速评价方法,为捕食相关基因功能验证提供了基础试验材料。
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S855.9;Q78

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本文编号：1301426