猪GPR120基因的转录调控机制及miR-25对肌肉细胞能量代谢的抑制作用研究

发布时间：2017-12-18 03:33

  本文关键词：猪GPR120基因的转录调控机制及miR-25对肌肉细胞能量代谢的抑制作用研究

  更多相关文章： 猪 GPR120 C/EBPβ miR-25 Akt1 AP-2α

【摘要】：能量代谢是动物生长、生产、繁育等重要生命活动的基础;同时与人类代谢综合症等息息相关。因此,对能量代谢调控进行研究不仅有助于提高动物生产经济效益同时对于改善人类健康也具有重大的意义。在本课题组前期的研究中,通过对大白猪的组织表达谱分析,发现GPR120是差异表达基因。GPR120基因参与能量平衡的多个生理过程,调节全身性能量和营养代谢平衡。本研究拟对GPR120基因进行研究,分析研究GPR120基因的转录调控机制,揭示GPR120基因在能量代谢调控过程的作用。本研究还基于胚胎期大白猪和通城猪的背最长肌组织的Solexa测序获得miR-25,通过分析miR-25序列,预测靶基因并进行功能分析验证;同时对miR-25的转录调控机制进行初步研究,探寻转录因子调节miR-25转录的分子机制。主要研究结果如下:1.猪GPR120基因的转录调控机制研究基于预测的启动子区域CpG岛分布情况构建GPR120基因启动子区域的缺失片段双荧光素酶载体,双荧光结果显示缺失片段P5(-323/+165)是GPR120基因核心启动子区域。使用TFSEARCH ver.1.3网站预测GPR120基因核心启动子区域中有与能量代谢相关的转录因子C/EBPβ的结合位点(TGTCG);而且在人、小鼠和猪三个物种,GPR120启动子区域中的C/EBPβ结合位点高度保守。通过定点突变实验证明转录因子C/EBPβ结合位点的突变显著地抑制了GPR120启动子的转录活性;而且通过ChIP实验表明,在体内环境中,转录因子C/EBPβ可以与GPR120基因核心启动子结合。超表达C/EBPβ显著性促进了GPR120和PPARγ基因的表达;而干涉C/EBPβ的表达则显著性抑制了GPR120基因的表达。此外,我们的实验结果还表明,高能饲喂(HFD-feeding)能够促进小鼠脂肪组织中GPR120,C/EBPβ和PPAR-γ2基因的表达,并且能够增强转录因子C/EBPβ与GPR120基因启动子区域的结合能力。2.miR-25在肌肉细胞能量代谢中的作用对C2C12成肌细胞进行成肌诱导分化,检测结果表明:小鼠miR-25-3p的表达量在C2C12成肌细胞分化过程中呈现先下调后上调的变化趋势。在转染miR-25-3p mimics的实验组中,检测结果表明肌肉细胞能量代谢的标志基因PI3K、Map2k4的表达水平显著下降。运用多种miRNA靶基因预测生物信息学网站预测miR-25-3p靶基因,发现Akt1基因的3’UTR区域有miR-25-3p的结合位点,而且序列比对分析发现在哺乳动物中Akt1基因的miR-25靶位点序列具有高度的保守性。双荧光结果显示,miR-25-3p显著地抑制了Akt1-3’UTR的荧光活性,说明miR-25-3p能够识别Akt1基因的3’UTR上的miR-25-3p靶位点并与其发生特异性结合。超表达miR-25-3p可以显著性下调Akt1和PI3K基因的mRNA表达水平;与此同时,miR-25-3p的超表达导致了Akt1和PI3K蛋白表达水平的下降。总之,miR-25-3p可以靶向基因Akt1,并抑制Akt1在mRNA和蛋白水平上的表达,进而可能影响PI3K/Akt信号通路的活化,调节肌肉细胞的能量代谢过程。3.小鼠miR-25转录调控机制的研究本研究中,我们克隆了小鼠miR-25-3p的5′端上游区域2034 bp序列并构建miR-25-3p启动子区域缺失片段荧光载体,荧光活性检测结果发现,缺失片段miR-25-3p-P9(-119/+144)是miR-25的核心启动子区域。使用生物信息学网站对miR-25核心启动子的转录调控元件进行预测分析,发现一个潜在的转录因子AP-2α结合位点。定点突变实验发现转录因子AP-2α结合位点的突变显著地抑制了miR-25启动子的转录活性。通过ChIP-Q-PCR实验证明:在体内环境中,转录因子AP-2α可以与miR-25启动子发生特异性地结合。而且通过ChIP-Q-PCR实验证明与C2C12细胞分化第8 d相比,转录因子AP-2α与miR-25启动子在C2C12细胞分化第0 d时结合能力更强。超表达AP-2α可以显著促进miR-25启动子的活性;而且超表达AP-2α可以显著性提高miR-25的mRNA表达量,同时也可以下调miR-25靶基因Akt1的mRNA和蛋白表达水平;与此一致,干涉AP-2α的表达显著性抑制了miR-25的mRNA表达量,同时也提高了基因Akt1的mRNA和蛋白表达量。上述实验结果证明AP-2α在miR-25转录过程中有着重要的调控作用,并且能够识别miR-25核心启动子区域的转录因子AP-2α结合位点,而且同时还发现转录因子AP-2α对miR-25靶基因Akt1的表达有抑制作用。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 杜娟,林戈,卢光t;人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选[J];遗传学报;2004年09期

2 邢少辰,林秀峰;分离基因的有效手段-mRNA差异显示技术[J];吉林农业科学;2004年02期

3 张冉;林浴霜;;不同品种鸡MSTN基因表达差异的研究[J];中国家禽;2012年06期

4 唐婷;柳峰松;任国栋;;谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测[J];昆虫学报;2008年11期

5 何蕾;薛仁宇;曹广力;胡小龙;贡成良;;基于RNA-Seq技术分析家蚕卵巢培养细胞(BmN)高表达基因[J];蚕业科学;2014年03期

6 杨红兰;张道远;刘燕;马瑞;张元明;;齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ALDH21的克隆与表达分析[J];基因组学与应用生物学;2010年01期

7 周鑫;柴保国;赵卫东;郑振宇;;小鼠早期胚胎发育过程中胚胎发育相关功能基因mRNA的表达[J];河南农业大学学报;2010年06期

8 王金玲;单雪松;杨雨江;王雪丽;;北京鸭/番鸭杂交体系肝脏组织基因表达差异的研究[J];家畜生态学报;2009年01期

9 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 张文俊;江华;赵耀忠;朱晓海;刘安堂;;皮肤恶性黑色素瘤与良性痣基因表达差异的研究[A];第四届华东六省一市整形外科学术会议暨2007年浙江省整形、美容学术会议论文汇编[C];2007年

2 杨劲松;郑新民;陈诗书;;诱导PTPα表达24小时NIH3T3细胞基因表达差异的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年

3 孟金萍;刘云波;张以河;孙淑华;王艳蓉;吕凤柱;杨旭;;铅暴露U251细胞基因表达谱改变及基因通路分析[A];实验动物与药理学、毒理学研究学术交流会论文汇编[C];2009年

4 刘丹慧;陈少松;罗崇林;肖雪媛;何大澄;;一个在肺癌中缺失的基因的筛选与初步研究[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年

5 宾晓农;谭敏;吕嘉春;蒋义国;陈家X;;基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因的研究[A];第五届广东省环境诱变剂学会暨第三届广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术交流会论文集[C];2006年

6 霍晓芳;张俊武;;红系分化相关基因的鉴别与功能研究[A];中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会论文汇编[C];2005年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 吴一福;第四军医大学发现抑癌新基因[N];中国医药报;2008年

2 柯尊洪;基因技术在中药研究中的作用[N];中国中医药报;2002年

3 王兴 闫智勇 郝晓锋;借助基因技术发展现代中药[N];中国医药报;2003年

4 本报记者 吴红月;医院病理科借助基因检测延伸新服务[N];科技日报;2014年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李倩;转Nramp1基因克隆牛的研制[D];西北农林科技大学;2015年

2 朱明库;番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果实成熟及非生物胁迫响应中的功能研究[D];重庆大学;2015年

3 陈鹏程;人类分子相互作用在线资源及多物种的基因集功能关联分析工具的建立[D];浙江大学;2015年

4 孙占斌;粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究[D];中国农业科学院;2015年

5 韩洪强;控制茄子果型相关性状关键基因的克隆及功能研究[D];上海交通大学;2014年

6 王X;牦牛基因组遗传变异图谱和高原适应的转录组研究[D];兰州大学;2015年

7 吴全金;‘白鸡冠’茶树响应光调控的基因差异及理化特征分析[D];福建农林大学;2015年

8 王春丽;AML1/ETO阳性白血病APP基因的临床意义、生物学功能及其作用机制研究[D];南方医科大学;2015年

9 高士刚;玉米弯孢叶斑病菌全基因组序列分析与致病性分化相关基因的研究[D];上海交通大学;2014年

10 严佳文;相橘溃病病防御相关基因的鉴定及功能分析[D];湖南农业大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 汤常永;梨‘中矮1号’矮生基因的筛选及PcAHS克隆与表达分析[D];中国农业科学院;2015年

2 王庆峰;胶质类芽孢杆菌胞外多糖调节及相关基因的转录分析[D];中国农业科学院;2015年

3 李博勋;橡胶树叶片受多主棒孢侵染后的差异表达基因分析及其抗病性相关基因的克隆[D];海南大学;2014年

4 刘俊莹;两品种鸭法氏囊差异表达基因、miRNA的富集及验证[D];四川农业大学;2015年

5 田凯;鸡RNF11基因的克隆及对先天免疫中相关基因表达的影响[D];四川农业大学;2015年

6 邵珊珊;鲈鲤免疫相关基因的克隆及日粮蛋白水平对其表达量的影响[D];四川农业大学;2015年

7 鲁静;茶树GA合成途径中若干相关基因的克隆及表达分析[D];福建农林大学;2015年

8 胡晓炜;白沙蒿转录组测序、分析及内参基因的鉴定和筛选[D];兰州大学;2016年

9 广璐;CRISPR/Cas9介导hFAD3基因在牛NCAPG-LCORL位点定点整合研究[D];内蒙古大学;2016年

10 张英;CRISPR/Cas9介导hFAD3基因在奶牛CSN2位点定点整合研究[D];内蒙古大学;2016年

，

本文编号：1302664