帕金蛋白通过增强自噬来缓解PrP106-126引起神经元凋亡的机制研究

发布时间：2017-12-19 02:27

  本文关键词：帕金蛋白通过增强自噬来缓解PrP106-126引起神经元凋亡的机制研究

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【摘要】：朊病毒病,即传染性海绵状脑病,是一类可以感染人类和野生动物的神经退化性疾病。在这些疾病中,一个核心事件是正常蛋白构象的改变,即正常朊蛋白(PrPc)从可溶的、主要为α螺旋的构象改变为富含p折叠、不可溶的、有蛋白酶抗性并具致病性和感染性的Prpsc。神经元或核内体中Prpsc的复制和蓄积导致了淀粉样的沉积,最终导致细胞毒性和细胞死亡。通常,动物的朊病毒疾病包括,牛海绵状脑病(Bovine spongiform encephalopathy, BSE)、绵羊和山羊的痒病、鹿和糜鹿的慢性消耗性疾病(Chronic wasting disease, CWD)、以及水貂的水貂传染性脑病(Transmissible mink encephalopathy, TME)。而在人中则包括库鲁病、克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、变异型克雅氏病(Variant Creutzfeldt-Jakob disease, vCJD)、致死性家族失眠症(Fatal familial insomnia, FFI)。尽管朊病毒疾病在人类中的发生率较低,但因为其独特生物学特性的传染源以及其他动物朊病毒疾病对于公共卫生健康的威胁,朊病毒疾病仍然受到人们的广泛关注。帕金蛋白是细胞质内蛋白,大小为53kDa,包含465个氨基酸残基和一个特殊的RING/HECT混合区域,这个混合区域中包括了两种主要的E3泛素连接酶。帕金蛋白在错误折叠蛋白的降解中发挥着重要的作用,而且其能调节K48连接的和K63连接的泛素化,从而实现对于多种底物的降解。帕金蛋白的变异与隐性遗传性少年型帕金森病(Autosomal recessive juvenile Parkinson's disease, ARJPD)相关。已有研究报道,帕金蛋白的表达减少了β样淀粉蛋白(Ap),并下调了阿兹海默症(AD)中淀粉样蛋白的表达。据研究,帕金蛋白可以减轻炎症、活性氧(ROS)以及氧化应激反应。在帕金森疾病(Parkinson's diseas, PD)中,帕金蛋白同样可以通过启动线粒体自噬,来调节功能异常线粒体的选择性自噬。帕金蛋白改善自噬缺陷、增强对于自噬体以及自噬泡的清除,进而导致阿兹海默症模型中Aβ的清除。在帕金蛋白中,比如多功能蛋白,具有广泛的神经保护功能,以应对广泛的神经毒性损伤,并被用于神经退行性疾病的治疗中。迄今为止,多数帕金蛋白的相关研究都是对于帕金森疾病或者阿兹海默病的,却几乎没有其在朊病毒疾病中作用的研究报道。本研究试图研究帕金蛋白在朊病毒疾病中可能存在的保护作用,并阐述帕金蛋白调控细胞保护的机制。为了研究帕金蛋白在朊病毒疾病中的作用,我们使用了N2a细胞模型和PrP106-126朊病毒多肽片段。PrP106-126保留了Prpsc聚集成淀粉样纤维的能力,因此,可用于体外研究朊病毒引起的细胞毒性和死亡。我们的结果显示PrP106-126处理细胞后,细胞内可溶性帕金蛋白水平呈现出平缓的、时间依赖性的减少。此外,免疫细胞学实验显示,内源性的帕金蛋白与FITC标记的106-126多肽片段存在共定位,提示二者之间的相互作用,导致泛素化作用从而清除PrP片段。通过pCMV-HA-Parkin质粒的转染,在N2a细胞中对帕金蛋白进行过表达,减轻了PrP106-126引起的凋亡；应用Annexin V FITC鉴定并量化凋亡细胞的百分比,显示帕金蛋白过表达的细胞组相对于pCMV-HA空载体细胞组,细胞凋亡率显著降低。同时,CCK-8的检测也显示,在PrP106-126处理后,pCMV-HA-Parkin表达组和空载对照组相比,细胞活力也有明显的提升。免疫印迹法分析自噬标志物显示,在PrP106-126处理之后,相对于空载对照组,白噬增强。帕金蛋白的过表达,同样降低了凋亡Bax蛋白向线粒体的转移、细胞色素C向胞质中的释放,进而抑制了促凋亡的caspase 9、caspase 12和caspase 3的活性。综上,我们的研究结果显示,帕金蛋白对于PrP106-126引起的神经毒性和细胞死亡是有保护作用的,而这种保护作用是通过促进自噬,减少内质网应激,抑制Bax蛋白向线粒体的转移,抑制细胞色素C的释放从而减轻促凋亡的Caspase蛋白的活性来实现的。尽管,对于更深层次地揭示促进自噬并明显调节细胞生存与死亡的因素仍需进一步的研究,但我们的研究显示,帕金蛋白可能在朊病毒疾病中具有重要治疗价值。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.3
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本文编号：1306564