杨树WRKY转录因子WRKY18、WRKY35和WRKY89在抗病过程中的功能分析

发布时间：2017-12-20 11:33

  本文关键词：杨树WRKY转录因子WRKY18、WRKY35和WRKY89在抗病过程中的功能分析　出处：《西南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：由于固生的生长方式,植物容易受到各种病原体的侵害,导致严重的疾病。在长期的进化过程中,植物发展出了复杂的调控机制来应对病原微生物的入侵,其中水杨酸(Salicylic acid,SA)及茉莉酸/乙烯(Jasmonic acid/ethylene,JA/ET)介导的抗病通路是植物两条主要的抗病途径。SA信号通路会激发出系统获得性抗性等免疫反应,如H2O2积累、病程相关基因(Pathogenesis-related genes,PR)表达、细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)等,最终导致植物对活体营养型病原菌的抗性增强。另一方面,JA/ET通路参与了植物抵御腐生寄生型病原菌入侵的过程。同时,SA和JA/ET信号通路之间也存在相互拮抗的作用,导致植物的抗病机制更加复杂。大量证据表明,WRKY转录因子家族成员在植物抗病方面已被证明具有关键作用。在木本模式植物杨树中,已有少量WRKY转录因子已被克隆并验证了其抗病功能,但关于WRKY抗病转录调控网络的研究尚未见报道。为此,本研究通过对杨树WRKY转录因子家族进行全基因组尺度的生物信息学分析,解析了各成员之间的进化关系,并预测了WRKY转录因子的冗余基因;另一方面通过转录水平分析,初步筛选得到了抗病相关的WRKY转录因子,进而深入解析了这些基因在杨树抗病中的生物学功能,初步搞清了杨树WRKY转录因子在SA抗病信号通路的转录调控网络。本论文主要研究结果如下:1.通过植物转录因子数据库和美国能源部植物基因组数据库Phytozome上毛果杨基因组信息,预测得到杨树所有WRKY转录因子家族成员。基于这些转录因子WRKY结构域的数目和锌指结构的不同,将100个杨树WRKY转录因子分为3个类型(第1族、第2族和第3族)。杨树WRKY转录因子家族的系统发生树分析和氨基酸序列比对发现第2族的成员还可细分为为IIa、IIb、IIc、IId、IIe五个亚族和一个独立成员PtrWRKY99。杨树WRKY基因在染色体上的定位分析得知,有82个WRKY基因非随机地定位到杨树染色体上,并存在明显的基因冗余现象。杨树WRKY蛋白保守氨基酸元件分析发现在杨树WRKY蛋白上存在多种与蛋白质功能相关的氨基酸元件,另外77个杨树WRKY转录因子含有核定位信号(NLS),暗示这些蛋白可能定位于细胞核。杨树wrky基因启动子分析发现在这些启动子上分布着大量与环境胁迫和植物激素响应相关的顺式作用元件和w盒,推测其与胁迫应答相关,并可能受到自身或者家族其它成员的调控。rna测序分析施加sa、茉莉酸甲酯(methyljasmonate,meja)、黑斑病(marssoninabrunnea)、机械损伤、盐处理和冷处理等处理的野生型毛白杨中wrky基因的表达水平,结果显示61%的基因表达会受到至少一种处理的影响。进一步发现在叶片中有较高表达的18个wrky基因对六种处理的应答有很大差异,其中ptrwrky60和ptrwrky89特异地受sa诱导。氨基酸序列比对发现ptrwrky89为杨树wrky家族第3族成员,ptrwrky54和ptrwrky62是其同源基因,暗示了在杨树中ptrwrky89,ptrwrky54和ptrwrky62存在功能冗余。在拟南芥中,ptrwrky89和atwrky70的同源性最高。通过启动子分析发现,ptrwrky89特异地在老叶中表达,而在嫩叶中的表达量极低。亚细胞定位实验和酵母转录自激活实验表明ptrwrky89是特异定位在细胞核的转录激活子。过量表达ptrwrky89的拟南芥与野生型拟南芥在在植株大小上无明显差异。通过接种丁香假单胞菌(pseudomonassyringaepv.tomatodc3000,pstdc3000)发现,转基因拟南芥叶片的褪绿速度明显快于野生型,总叶绿素的含量相比于野生型更低,叶肉中的细菌数目也显著多余野生型植株,这些结果表明过量表达ptrwrky89的拟南芥对pstdc3000的抗性明显低于野生型拟南芥,因此ptrwrky89可以降低拟南芥对pstdc3000的抗性。另外一方面,对转基因拟南芥和野生型拟南芥接种葡萄孢菌(botrytiscinerea)发现,转基因拟南芥叶片上的坏死面积明显大于野生型拟南芥,而b.cinerea在植株上的生长情况也反映转基因植株对b.cinerea的抗性明显低于野生型拟南芥,表明过量表达ptrwrky89会降低拟南芥对b.cinerea的抗性。通过荧光定量pcr分析过量表达ptrwrky89和野生型拟南芥中sa和ja介导的信号通路相关基因的表达情况,发现标志基因的表达量在转基因株系中都显著低于野生型拟南芥,表明在转基因株系中,sa和ja信号通路都遭到削弱。在杨树中,用杨树溃疡病(dothiorellagregaria)接种过量表达ptrwrky89的转基因杨树和野生型毛白杨,发现转基因杨树叶片上的坏死斑面积显著小于野生型毛白杨,表明转基因毛白杨对溃疡病的抗性显著增强。通过半定量pcr分析杨树中sa信号通路相关基因,发现sa信号的标志基因pr的表达量在转基因杨树中显著高于野生型毛白杨,表明ptrwrky89正向调控了杨树sa信号通路。另外,在过量表达ptrwrky89的毛白杨中,ptowrky18和ptowrky35的表达量相对于野生型也有明显上调,暗示了这两个基因可能参与调控了杨树sa信号通路,并可能受到ptrwrky89的调控。进一步分析启动子元件表明在ptrwrky18和PtrWRKY35的启动子上存在W盒,通过酵母单杂交实验证明PtrWRKY89可以直接结合这些W盒,因此Ptr WRKY18和PtrWRKY35是PtrWRKY89的靶基因。2.氨基酸序列比对发现,PtrWRKY18和PtrWRKY35是杨树IIa亚族的一对同源蛋白,都与拟南芥AtWRKY18关系较近,在蛋白的N端存在一个假定的亮氨酸拉链结构。启动子分析发现,PtrWRKY18主要在杨树幼叶的叶脉和幼嫩的茎部表达,而PtrWRKY35在杨树中的表达量十分微弱,在拟南芥中,Ptr WRKY18和PtrWRKY35的启动子受到SA和病原微生物的诱导。亚细胞定位实验和酵母自激活实验表明PtrWRKY18和PtrWRKY35特异定位于细胞核,且无转录激活活性。酵母双杂交表明PtrWRKY18和PtrWRKY35的亮氨酸拉链结构与AtWRKY18的不同,不能介导PtrWRKY18和PtrWRKY35形成同源或异源二聚体。在拟南芥中分别过量表达PtrWRKY18和PtrWRKY35会导致转基因拟南芥对Pst DC3000的抗性降低而对B.cinerea的抗性增强。进一步检测拟南芥中SA和JA信号通路相关基因的表达情况,发现SA信号通路减弱而JA信号通路增强。在杨树中,过量表达PtrWRKY18或PtrWRKY35都会提高转基因杨树对杨树叶锈病(Melampsora medusae)的抗性,而两基因的突变体杨树对叶锈病的抗性与野生型相比并无明显差异。进一步发现Ptr WRKY18和PtrWRKY35过量表达杨树中PR基因的表达量明显提高,而突变体杨树与野生型相比无显著差异。综上所述,通过对杨树WRKY基因家族的生物信息学分析,筛选得到受SA诱导的PtrWRKY89,并证明PtrWRKY89可以通过直接控制PtrWRKY18和PtrWRKY35的表达正向调控杨树SA信号通路,从而增强杨树的抗病性。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S763.7
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本文编号：1311948