中国野生华东葡萄泛素连接酶基因VpPUB24功能研究

发布时间：2017-12-20 22:03

  本文关键词：中国野生华东葡萄泛素连接酶基因VpPUB24功能研究　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：葡萄是世界范围内被广泛栽培利用的重要果树之一,特别是欧洲葡萄(Vitis vinifera L.),其品种在葡萄生产上占主导地位,既可用于鲜食,又可用于制汁,制干和酿酒等加工用途,具有良好的食用品质和商业价值,为人类创造了巨大经济效益。但是,欧洲葡萄绝大多数品种不抗病,尤其是白粉病。我国是世界葡萄起源中心之一,拥有丰富的野生葡萄资源,其中,中国野生华东葡萄白河-35-1高抗葡萄白粉病。本研究以白河-35-1为材料,分离获得U-box类型的泛素连接酶中与抗白粉病相关基因,分析基因结构,对基因表达模式与调控抗性功能进行研究,取得的主要结果如下:(1)采用RT-PCR技术检测得到中国野生华东葡萄白河-35-1中56个U-box类型的泛素连接酶基因在接种白粉菌后表达情况,发现VpPUB24基因受白粉菌诱导表达。(2)采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)克隆技术获得泛素连接酶VpPUB24的cDNA序列,VpPUB24全长为1457 bp,开放读码框1236 bp,编码411个氨基酸,具有一个N端的U-box保守结构域和4个串联的ARM保守结构域,其GenBank登录号为:KU296025。同时还克隆了三个欧洲葡萄品种红地球、赤霞珠和无核白葡萄中PUB24基因,比对分析发现VpPUB24氨基酸序列与三种欧洲葡萄中VvPUB24氨基酸序列一致性为100%。(3)克隆VpPUB24基因启动子片段,并构建PVpPUB24-GUS融合载体,转入农杆菌GV3101后瞬时转化白河-35-1葡萄叶片后进行不同的生物和非生物胁迫处理,并进行启动子GUS蛋白活性定量分析。结果表明VpPUB24基因受葡萄白粉菌、SA、MeJA及4℃低温处理诱导表达。同时克隆了红地球、赤霞珠和无核白葡萄中PUB24基因启动子序列,通过PlantCARE网站分析表明欧洲葡萄PUB24启动子中的一个P-box元件在华东葡萄白河-35-1葡萄中被一个TCA-element所取代。GUS组织化学染色试验表明,不同葡萄中PUB24启动子均受白粉菌和SA诱导表达,并且华东葡萄白河-35-1和三个欧洲葡萄品种PUB24启动子受白粉菌和SA诱导表达情况存在一定差异。(4)构建中国野生华东葡萄白河-35-1的酵母cDNA文库,通过酵母双杂交技术筛选到VpPUB24蛋白的两个互作蛋白VpICE1和VpEXO70B1。VpICE1是一个bHLH类型的转录因子基因,开放读码框为1551 bp,编码516个氨基酸,其GenBank登录号为:KU296026。VpEXO70B1是EXO70家族的基因,是胞外分泌复合体(Exocyst)的一个亚基,参与细胞胞吐和囊泡转运,其具有一个EXO70保守结构域,开放读码框为1884 bp,编码627个氨基酸,其GenBank登录号为:KU507498。(5)通过双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)试验证明了VpPUB24与VpEXO70B1的互作关系。克隆了与VpPUB24基因序列一致性最高的VpPUB23基因,通过酵母双杂交验证明VpPUB23与VpEXO70B1蛋白不互作,说明VpPUB24与VpEXO70B1蛋白的互作具有特异性。通过烟草叶片瞬时表达系统证明了VpEXO70B1蛋白的降解受泛素化调控,VpPUB24促进VpEXO70B1蛋白降解。将VpPUB24基因稳定整合到拟南芥后,发现VpPUB24基因通过调控水杨酸路径上关键节点基因的表达,负调控对白粉菌的抗性。并通过亚细胞定位分析发现VpPUB24与VpEXO70B1蛋白的亚细胞定位受到SA的影响。克隆了华东葡萄白河-35-1、红地球、赤霞珠和无核白葡萄中EXO70B1基因及启动子,通过GUS组织化学染色分析表明,不同葡萄EXO70B1基因均受白粉菌和SA诱导表达。通过葡萄叶片瞬时表达试验,证明了VpPUB24和VpEXO70B1基因通过调控SNC1、NPR1、PR1等基因的表达参与对葡萄白粉菌抗性的调控。(6)通过酵母双杂交试验证明了VpPUB24还与VpICE1互作,其C端的ARM结构域介导与VpICE1的C端ACT结构域互作;BiFC和Co-IP试验也证明了VpPUB24与VpICE1蛋白互作。通过酵母双杂交试验发现VpPUB24也与葡萄中ICE家族的另外两个成员VpICE2和VpICE3互作;进一步分析表明,VpICE1蛋白的降解受泛素化调控,但VpPUB24促进VpICE1蛋白的积累。还克隆了VpHOS1基因,通过酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明了VpHOS1与VpICE1蛋白互作,蛋白降解试验证明了VpHOS1促进VpICE1蛋白的降解,而VpPUB24通过抑制VpHOS1蛋白的积累促进VpICE1蛋白的积累。此外,还通过酵母双杂交试验证明了VpHOS1与VpPUB24蛋白在酵母中互作。通过转基因拟南芥分析表明,VpPUB24通过调控ICE1-CBF/DREB1路径相关基因表达正调控对低温的抗性。综上所述,中国野生华东葡萄白河-35-1泛素连接酶基因VpPUB24不仅能调控对低温的抗性,而且还具有调控抗白粉病的功能。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S663.1
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本文编号：1313552