MiR-26家族对奶山羊乳腺脂肪酸代谢的调控作用研究

发布时间：2017-12-21 02:00

  本文关键词：MiR-26家族对奶山羊乳腺脂肪酸代谢的调控作用研究　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： miR-26家族 CTDSP家族 协同调控 脂肪酸代谢 DNA甲基化

【摘要】：MiR-26家族属于内含子miRNA,位于羟基末端RNA聚合酶Ⅱ多肽小磷酸酶(CTDSP)家族基因的内含子区。MiR-26a-1定位于3号染色体,位于CTDSPL基因的第5内含子;MiR-26a-2定位于5号染色体,位于CTDSP2基因的第4内含子;MiR-26b定位于2号染色体,位于CTDSP1基因的第4内含子;miR-26a-1和miR-26a-2的成熟体miRNA序列相同。MiR-26可直接作用于LXR的靶基因ABCA1和ARL7,参与细胞胆固醇外流过程;在脂肪细胞中,miR-26b的表达量受到肿瘤坏死因子、瘦素及抑制素的调控,抑制miR-26b会阻碍脂肪细胞的分化,降低脂合成marker基因C/EBPα和PPARG表达量,下调细胞内甘油三酯和脂滴的积累。乳腺作为一种特殊的白色脂肪组织,在泌乳过程中脂肪酸代谢非常活跃,因此,奶山羊miR-26家族的功能及转录调控研究对揭示反刍动物乳脂形成的机制具有重要意义,为探讨miRNA在乳腺脂肪酸代谢调控网络中的重要作用奠定基础。本研究在分析泌乳中期乳腺组织miR-26及宿主基因表达量与乳成分及乳脂肪酸成分含量相关性的基础上,通过miRNA类似物和抑制剂介导的超表达和干扰技术探讨miR-26a和miR-26b对乳腺脂肪酸代谢的调控作用,并同时干扰miR-26及其宿主基因家族探究其对脂肪酸代谢的协同调控作用;通过对山羊miR-26家族基因启动子的克隆和突变研究,以及脂代谢关键转录因子对miR-26家族DNA甲基化水平的影响,系统研究上游调控因子对miR-26家族的转录调控机制。本研究的主要结果如下:1.山羊miR-26家族生物信息学分析及其与乳成分和乳脂肪酸成分的相关性研究对miR-26家族同源性分析结果表明,miR-26家族在山羊、牛、人、小鼠、绵羊中高度保守,且具备相同的种子序列。利用Target Scan和Pic Tar在线软件预测miR-26家族的靶基因,并利用Kobas在线软件的GO和KEGG模块对靶基因的功能进行富集,结果表明miR-26家族的靶基因参与到Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Hippo信号通路(Hippo signaling pathway)、m TOR信号通路(m TOR signaling pathway)、脂肪酸合成通路(Fatty acid biosynthesis)等与乳脂代谢重要的信号通路中。在不同泌乳时期分析miR-26及其宿主基因(CTDSP)家族表达量表明,miR-26及CTDSP家族在泌乳期的表达量显著高于干奶期,在泌乳盛期表达量达到最高峰,且表达趋势一致。在泌乳中期对miR-26a/b与CTDSP1/2/L表达量进行皮尔逊相关性分析,发现miR-26a与miR-26b呈现出极强的正相关性,且miR-26a与CTDSP2、miR-26a与CTDSPL、miR-26b与CTDSP1呈现显著中度相关。miR-26及CTDSP家族与乳成分及乳脂肪酸成分含量相关性分析表明,miR-26a/b和CTDSPL与乳中总脂固形物含量显著中度相关,而与乳产量、乳糖、乳蛋白及非脂固形物无显著相关性;miR-26a与C6:0、C14:1、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1及C18:3,miR-26b与C6:0、C14:1、C16:1、C18:0及C18:3,CTDSP1与C10:0、C11:0、C12:0、C14:0、C15:0、及C18:3,CTDSP2与C14:1,CTDSPL与C6:0、C14:1、C16:1、C18:0及C18:1均呈现中度相关。2.山羊miR-26家族对脂肪酸代谢的协同调控作用研究在原代山羊乳腺上皮细胞(GMEC)中单独转染miR-26a和miR-26b mimic后,与对照组相比miR-26a和miR-26b表达量显著上调,脂肪酸从头合成(FASN、ACACA)、甘油三酯合成(GPAM、DGAT1和LPIN1)、脂肪酸去饱和(SCD1和FADS2)、脂肪酸合成关键转录因子(PPARG、SREBP1和LXRA)和脂滴形成(PLIN2)相关基因的表达量显著上调;细胞内甘油三酯含量和脂滴积累增加;不饱和脂肪酸C16:1和C18:2含量显著增加,饱和脂肪酸C16:0含量显著降低;且脂肪酸合成相关基因PPARG、SREBP1、FASN和SCD1基因DNA甲基化水平下降。与miR-26a处理组相比,miR-26a和miR-26b共同转染细胞后脂合成相关基因FASN、GPAM、DGAT1、LPIN1、FADS2、SREBF1、PIN2的表达水平显著上调,且细胞中脂滴积累增加。相对于miR-26b处理组,miR-26a和miR-26b共同处理组脂合成相关基因FASN、ACACA、LPIN1、SCD1、FADS2、PPARG、SREBF1表达量显著上调,且不饱和脂肪酸C18:1含量显著上调,饱和脂肪C16:0含量显著下调。靶基因预测结果表明,胰岛素诱导基因1(INSIG1)是miR-26家族影响脂肪酸代谢的一个潜在靶基因,RT-q PCR和Western blot实验表明,激活miR-26家族,INSIG1的m RNA和蛋白水平均显著下调,且荧光素酶实验结果表明,miR-26家族可以直接作用于INSIG1基因3′-UTR。3.山羊miR-26及宿主基因家族对脂肪酸代谢的调控作用研究设计并合成miR-26家族inhibitor和特异性靶向CTDSP1、CTDSP2和CTDSPL基因的si RNA,转染GMEC后,miR-26和CTDSP家族的表达量显著下调(大于70%);抑制miR-26a或miR-26b,脂合成相关基因FASN、ACACA、GPAM、LPIN1、DGAT1、SCD1、PLIN2、CD36、PPARG、SREBP1、LXRA表达量均显著下调,靶基因INSIG1表达量显著上调,导致甘油三酯含量和脂滴积累减少,细胞内C16:0、C18:0含量显著增加,而C16:1和C18:1含量显著下降,当共同转染miR-26a和miR-26b抑制剂时,对以上脂肪酸合成相关指标的影响具有协同抑制作用。转染CTDSP家族si RNA后,脂合成相关基因(如SREBP1)显著下调,ISNIG1基因显著上调,甘油三酯含量、脂滴积累、不饱和脂肪酸C16:1和C18:1含量显著下降,饱和脂肪酸C16:0含量显著增加,同时干扰miR-26a/b及其宿主基因后,对脂合成相关基因CD36、FASN、LXRA和SREBP1的表达量具有协同抑制作用。4.山羊miR-26a启动子与脂代谢重要转录因子的关系研究分别克隆得到miR-26a-1和miR-26a-2基因5′侧翼序列1274 bp和1183 bp,对启动子序列上转录因子结合位点和Cp G岛进行生物信息学分析,发现miR-26a-1启动子上分别含有三个PPRE和SRE位点,含有一个典型的Cp G岛;miR-26a-2启动子上含有三个PPRE、三个SRE和一个LXRE位点,含有两个典型的Cp G岛。超表达SREBP1、PPARG和LXRA可显著上调miR-26a和CTDSP2/L表达水平,下调miR-26a-1和miR-26a-2启动子DNA甲基化水平。荧光素酶活性试验结果表明,激活SREBP1、PPARG和LXRA可显著上调miR-26a-1和miR-26a-2启动子活性。缺失突变结果表明,miR-26a-1启动子上PPRE1、SRE1或SRE2位点的突变可导致启动子活性显著下降;PPRE1突变后,激活PPARG表达并不能上调启动子活性;SRE1或SRE2位点突变,导致SREBP1对miR-26a-1启动子的激活作用减弱,同时突变SRE1和SRE2,SREBP1对其启动子活性无激活作用。Ch IP实验结果表明,SREBP1蛋白可与miR-26a-1启动子上的SRE1和SRE2位点结合,直接参与miR-26a-1的转录调控;SRE1和SRE2同时突变,LXRA对启动子活性无影响,表明LXRA通过SREBP1间接调控miR-26a-1的表达。利用相同方法证明miR-26a-2启动子上PPRE3、SRE1位点对其启动子活性的维持具有重要作用。LXRE突变,LXRA对启动子活性的激活作用减弱,而同时突变LXRE和SRE1导致LXRA对miR-26a-2启动子的激活作用消失,表明LXRA通过直接和间接两种方式参与调控miR-26a-2的表达。5.山羊miR-26b启动子与脂代谢重要转录因子的关系研究PCR扩增得到miR-26b基因5'侧翼序列1102 bp(包含转录起始位点上游1018 bp和下游84 bp),对启动子序列分析发现,miR-26b启动子上含有四个PPRE、四个SRE位点和两个LXRE位点,并含有三个典型的Cp G岛。激活SREBP1、PPARG和LXRA可显著上调miR-26b和CTDSP1的表达水平,并下调miR-26b启动子DNA甲基化水平。启动子荧光素酶活性分析结果表明,激活SREBP1、PPARG和LXRA可显著上调miR-26b启动子活性。定点突变结果表明,miR-26b启动子上PPRE1、PPRE2、SRE1或SRE3位点的突变可导致启动子活性显著下降,而LXRE位点的突变对启动子活性无影响;PPRE1或PPRE2单独突变均使下调PPARG对miR-26b启动子活性的激活作用,而同时突变导致PPARG对miR-26b启动子活性激活作用消失。SRE1或SRE3单独突变,导致SREBP1对miR-26b启动子的激活作用减弱,同时突变SRE1和SRE3,SREBP1对其启动子活性无激活作用,Ch IP实验结果表明,SREBP1蛋白可与miR-26b启动子上的SRE1和SRE3直接结合,参与miR-26b的转录调控;LXRE突变后,激活LXRA对miR-26b启动子活性无影响,而突变SRE1或SRE3导致LXRA对miR-26b启动子活性激活作用减弱,同时突变SRE1和SRE3导致LXRA对miR-26b启动子活性的激活作用消失。综上所述,miR-26家族通过多种机制参与细胞内甘油三酯合成、脂滴积累及不饱和脂肪酸的合成等生物过程,是反刍动物乳脂代谢的重要调控因子。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S827

【相似文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王会;MiR-26家族对奶山羊乳腺脂肪酸代谢的调控作用研究[D];西北农林科技大学;2017年

，

本文编号：1314223