水稻中调控抽穗期的关键基因OsCOL13的克隆与生化分析

发布时间：2017-12-21 10:41

  本文关键词：水稻中调控抽穗期的关键基因OsCOL13的克隆与生化分析　出处：《湖南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：水稻(Oryza sativa)作为重要的粮食作物之一,为全世界数十亿的人提供能量。水稻是一个短日照植物,在开花方面表现出强烈的光周期敏感性。开花在植物整个生命周期中起着重要的作用,它决定了植物对不同外部环境的适应性,同时也受到内部信号和外界环境刺激的影响。在所有的开花调控因子中,光周期是最重要且被广泛研究的影响因素。目前许多参与到光周期途径的基因已经在长日照植物拟南芥以及短日照植物水稻中被鉴定出来,同时建立起了Os GI/GI-Hd1/CO-Hd3a/FT信号调控网络。其中CONSTANS(CO)作为拟南芥的开花整合子在长短日照条件下都促进开花。但水稻中CO的同源基因Heading date1(Hd1)却起到双重相反的功能,它在长日照条件下抑制开花,在短日照条件下诱导开花。在本研究中,我们发现了一个水稻CONSTANS-like(COL)基因OsCOL13,它参与到水稻光周期开花调控过程中。为了研究OsCOL13在开花调控中所起的作用,我们通过遗传学、分子生物学、生物化学和细胞学等技术手段对OsCOL13的功能进行了深入解析。主要研究结果如下:(1)OsCOL13抑制水稻开花。无论在短日照条件(14 h黑暗/10 h光照)还是在长日照条件(10 h黑暗/14 h光照)下,OsCOL13过表达植株都比野生型Kitaake延迟开花3周左右。同时,将OsCOL13基因过表达到另外两种光周期敏感的粳稻品种中花11和W030中,转基因植株开花时间也显著延迟。利用CRISPR-Cas9技术我们获得了三个独立的OsCOL13突变体,但突变体与野生型相比开花时间没有明显变化,暗示OsCOL13可能与其它的Os COL基因存在功能冗余。(2)OsCOL13主要在叶片、叶鞘、茎杆以及穗子中表达,在根中相对比较低,同时在不同发育阶段叶片中的表达维持稳定。此外,GUS组织化学染色实验发现,在所有组织中都能检测到GUS活性,暗示OsCOL13组成型表达。原位杂交显示OsCOL13在叶片的叶肉细胞中大量表达。(3)OsCOL13是一个节律表达的基因,其表达受到光照和节律钟的调控。OsCOL13的转录水平在长短日照下都是从傍晚开始积累,在黎明时达到最大,之后迅速降低直至傍晚。OsCOL13的表达在整个营养生长阶段没有太大的变化,并且长日照下的表达量要高于短日照条件下的表达量,同时在全光照条件下OsCOL13能维持节律性振幅也没有改变,而在全黑暗条件下虽然还能维持节律表达,但其振幅急剧减少。(4)通过在水稻原生质体中观察OsCOL13-GFP融合蛋白的荧光信号,发现OsCOL13严格的定位于细胞核中,与核参照蛋白D53-m Cherry完全重叠。OsCOL13-BD融合蛋白与BD对照相比在酵母菌株AH109中展现出更强的转录激活活性,并且激活域位于B-box和CCT两个保守的结构域之间,与已报道的CO和DTH2相类似。这些结果表明,OsCOL13可能作为一个转录激活子调节下游基因的表达。(5)OsCOL13与自身互作,以同源二聚体的形式行使功能。当用Flag标签抗体检测过表达植株中OsCOL13-Flag融合蛋白时,我们发现一条约为70 k Da的条带,它是OsCOL13-Flag单体蛋白的两倍。随着提取缓冲液中DTT浓度的增加,70 k Da条带逐渐减弱,而一条35 k Da的条带逐渐增强。暗示OsCOL13可能以二聚体的形式存在。此外,体外pull-down和Bi FC实验进一步证实OsCOL13可以形成二聚体。(6)OsCOL13在水稻开花调控网络中位于Osphy B的下游Ehd1的上游。OsCOL13作为一个组成型的负调节子,通过下调Ehd1的表达进而抑制Hd3a和RFT1的表达,从而延迟开花,并且独立于其它的Ehd1调节子。通过在水稻开花相关的近等基因系以及突变体中检测OsCOL13的转录水平,发现OsCOL13的表达量在osphyb突变体中显著降低,暗示Osphy B可能促进OsCOL13的表达。(7)OsCOL13直接调控OsLBD38的表达。转录谱分析发现OsLBD38基因可能直接受OsCOL13的调控。染色质免疫共沉淀以及萤火虫荧光素酶实验进一步证实,OsCOL13直接结合到OsLBD38的启动子上调控它的表达。但OsLBD38过表达植株的开花时间与野生型相比差异不显著,暗示OsLBD38受到OsCOL13的直接调控,在水稻体内发挥其它未知的功能。
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511;Q943.2

【参考文献】

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本文编号：1315753