柿果实品质特性、香气成分分析及醇酰基转移酶基因（DkAAT1）的表达研究

发布时间：2017-12-21 18:25

  本文关键词：柿果实品质特性、香气成分分析及醇酰基转移酶基因（DkAAT1）的表达研究　出处：《扬州大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：柿(Diospyros kaki L.)属于柿科(Ebenaceae)柿属(Diospyros),是一种重要的商业和落叶果树。中国是柿的起源国之一,也是世界上最大的柿生产国。虽然柿在不同的国家种植,并且由于其营养价值、健康效益和丰富的口味越来越受到人们的青睐,令人惊奇的是在风味方面开展的研究很少,尤其是负责挥发性香气合成的基因,而香气被人们视为确定果实质量和消费者接受度的重要特征之一。在基因水平上通过对果实香气的影响来评价挥发物是旨在提高果实质量的有用工具。最近在组学技术方面的进展导致了编码负责许多挥发物的生物合成的酶基因获得分离,并且有助于我们对挥发性化合物形成相关调控机制的理解。在本研究中,柿果实被用作植物材料,以评估34种不同品种柿果实的主要品质特征,并研究乙烯和水杨酸对“小方柿”和“奶油柿”两个品种不同成熟阶段主要品质特征的影响。同时,我们也测定了两个不同品种不同成熟阶段的柿果实的芳香挥发性物质。在此基础上,对醇酰基转移酶基因进行了克隆和鉴定,并评价了乙烯和水杨酸对“小方柿”和“奶油柿”不同成熟阶段醇酰基转移酶基因表达模式的影响。此外,通过转录组分析建立了柿果实转录序列数据库,并鉴定了香气生物合成相关的候选基因。主要研究结果如下:1.甜柿品种平均单果重大于涩柿,而涩柿品种果形指数的差异大于甜柿品种。此外,涩柿品种的平均TSS高于甜柿,而甜柿和涩柿的TA基本一致。另一方面,结果表明,“小方柿”和“奶油柿”两个品种不同成熟期的果实重量、果径和果形指数等主要果实品质指标没有显著差异,而果实硬度和TSS表现出明显的差异。依稀处理的果实硬度和TSS最高,对照次之,而水杨酸处理的果实硬度和TSS最低。2.不同柿品种的果实颜色比较表明,与甜柿相比,涩柿果皮和果肉显示更深的橙红色。此外,“小方柿”和“奶油柿”果实的色调角(H°)在采收的时候较高,然后在不同处理不同成熟阶段均下降,表现为果实颜色橙色加深。3.在8个甜柿和26个涩柿品种柿果实的顶空部分鉴定了许多不同的挥发性化合物,分别是48种和61种。通常挥发性化合物因品种不同而变化。苯甲醛、环丙基甲醇、2-乙基-1-己醇、壬酮、β-紫罗兰酮和乙酸龙脑酯是甜柿品种中最主要的醛类挥发物,而涩柿中产生的最主要的醛类挥发性成分是癸醛、2-乙基-1-己醇、β-紫罗兰酮、壬酮、乙酸苄酯和乙酸龙脑醋。另一方面,己醛、环丙基甲醇、6-甲基-庚-5-烯-2-酮和乙酸乙酯,2-己烯醛、环丙基甲醇、壬酮、乙酸乙酯和乙酸丁酯分别是甜柿和涩柿中最丰富的挥发物。此外,在在“小方柿”和“奶油柿”不同成熟阶段果肉的顶空部分中分别鉴定出42种和34种不同的挥发性化合物。壬酸、(Z)-9-十六碳烯-1-醇、3-三癸醇、3-羟基-2-丁酮和苄基乙酸酯是不同成熟阶段产生的最主要的挥发物。在“奶油柿”中,乙醛、壬醛、(Z)-9-十六碳烯-1-醇、芳樟醇、2-乙基-1-己醇和1-辛醇是不同成熟阶段柿果中最主要的挥发物;而在不同成熟阶段,3-羟基-2-丁酮是果实中唯一产生的酮类成分。4.在定量的酯类成分中,结果表明,苄基乙酸酯是“小方柿”不同成熟阶段产生的最主要的酯,而乙酸乙酯和乙酸甲苯基苯酯则是“奶油柿”不同成熟阶段产生的最主要的酯。另一方面,乙酸丁酯和乙酸乙酯均是两个品种中产生的最丰富的酯类。一般来说,与其他处理相比,“小方柿”果实中醛类、酮类、酯类和酸类挥发性成分含量分别在处理后9 d、15 d、15 d和12 d最高,对照水果在处理后第15 d为醇类含量最高。用水杨酸处理的“奶油柿”果实具有最高的醛类、醇类、酮类和酸类,而用乙烯处理的果实中产生的酯类最高。5.通过将丁醇和酰基-CoA转化成相应酯的能力来定量DkAAT蛋白质的AAT活性。结果表明柿子果实不同成熟阶段呈现不同变化趋势。然而,在“小方柿”和“奶油柿”两品种果实中,分别在水杨酸处理后第12 d和第15 d具有最高的AAT活性。6.通过应用具有特异性引物的3'-和5'-RACE策略来实现DkAAT1的克隆。3'-和5'-cDNA末端的剪接结果显示,DkAAT1cDNA全长为1637bp,包含ATG起始密码子、1380bp的开放阅读框(ORF)、TAA终止密码子、75 bp的5'-非翻译区(5'-UTR),182bp的3'-UTR和编码459个氨基酸的poly(A)尾巴。此外,DkAAT1已在GenBank提交,登录号为KP271995。利用GenBankBLAST进行同源性分析,结果表明推导的氨基酸序列与其他植物编码AAT的序列具有很高的相似性。另一方面,为了分析柿AAT家族的复杂性,使用Southern blotting进行基因组分析。结果表明所有测试的限制酶均存在一个拷贝的DkAAT基因。7.通过RT-qPCR分析DkAAT1在不同组织器官及两个不同品种成熟果实中的表达情况。结果表明,不同组织中表达差异显著,在分析的不同组织中,花瓣显示最高的转录本积累,其次是叶片,而果实显示最低的转录本积累。通常,与“奶油柿”相比,DkAAT1基因在“小方柿”品种中高度表达,而且两个品种果皮中表达水平均高于果肉。此外,试验还进行了乙烯和水杨酸对两个不同品种柿果实表达水平的影响,结果表明,在不同成熟阶段的所有果实中都观察到转录产物的积累。然而,不同处理间在不同成熟阶段的表达水平表现出显著差异。总体来说,“小方柿”在成熟期间观察到DkAMT1转录产物的显著增加,乙烯处理果实、水杨酸处理果实分别在第9、12 d达到最高水平,相对表达量分别为53.99和40.76。而“奶油柿”果实转录本在乙烯处理果实、水杨酸处理果实中,分别在第12、9d达到最高水平,相对表达量分别为31.73 和 5.08。8.利用IlluinaHiseqTM 2000平台对柿果实进行从头转录组测序分析,结果表明从果肉cDNA文库中产生84759380个原始阅读文库,获得81973802个高质量的干净阅读文库,组装成平均长度为642 nt的71194个功能基因。KOG(真核细胞直系同源组)聚类分析显示有26个不同的功能分类,其中最大的一组是预测的一般功能,然后是转录功能的一组。在GO(基因本体)分类中,功能分类中三个百分比最大的基因组分别是细胞过程、结合与代谢。随后的KEGG(京都基因与基因组百科全书)路径分析表明翻译途径表现出最大的单基因(unigenes)数目,然后碳水化合物代谢,而膜转运路径单基因数目最少。此外,转录组分析创建了一个柿果实转录序列数据库用于鉴定挥发性香气成分生物合成相关基因,尤其是醇酰基转移酶(AATs)、脂肪酸过氧化裂解酶(HLP)、3-酮酰辅酶A硫解酶(THMF)和类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S665.2
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本文编号：1316735