犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究

发布时间：2017-12-22 00:27

  本文关键词：犬瘟热病毒、犬细小病毒及狂犬病毒三联多表位重组蛋白的构建及其免疫效果研究　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：犬瘟热(Canine distemper)、犬细小病毒病(Canine parvovirus enteritis)和狂犬病(Rabies)是三种主要的在全球范围内传播的犬科、猫科动物疫病。目前针对三种疫病唯一有效的防控办法就是疫苗免疫接种,但目前在临床中使用的常规疫苗存在诸多不足之处。多表位疫苗是基于抗原表位氨基酸序列而制备的一种新型疫苗,因其安全性好、保护力强和应答类型可调控等特点,近年来备受关注。本研究的主要目的是构建CDV、CPV和RV的主要保护性抗原多表位重组蛋白,利用原核表达技术进行表达,并对其免疫原性进行研究。同时,也对新型免疫佐剂聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)的免疫增强效果进行了研究,为研制犬类CDV、CPV和RV病毒多表位重组疫苗奠定了基础。本研究通过对已报道的多个有价值的CDV、CPV和RV的T细胞和B细胞表位进行分析和评价,最终选择了 13个不同的表位用于构建多表位重组蛋白。包括CDV的2个B细胞表位,2个Th细胞表位及1个CTL细胞表位;CPV的2个B细胞表位及1个Th细胞表位;RV的2个B细胞表位,1个模拟空间B细胞表位,2个Th细胞表位及1个CTL细胞表位。各候选表位按照一定规则排列后通过连接子GGGGS或KK连接以保持各表位的独立构象。对这些重组蛋白序列的亲水性、抗原性、折叠性、表面可及性、二级结构和三级结构等进行预测分析,最终优选出6个不易形成二级结构、不易组成新表位的重组蛋白序列rP1、rP2、rP3、rP4、rP5和rP6。编码这6个蛋白的基因序列经密码子优化后进行全基因合成,再克隆至原核表达载体上,其中rP1、rP2和rP3克隆到pET-28a(+),rP4、rP5和rP6克隆到pET-30a(+)上。SDS-PAGE检测结果表明,上述重组质粒转化的BL-21(DE3)经IPTG诱导后均以包涵体的形式表达。Western blotting试验结果证明,经镍柱纯化及蛋白复性操作,成功获得了 6个含有His标签的高纯度重组蛋白。6个重组蛋白和三个灭活病毒经弗氏佐剂乳化后免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,三免后14天采血制备鼠源多抗血清。ELISA和Western blotting试验结果显示,6个蛋白能够与各自免疫后的抗血清发生反应;同时也能和上述三种灭活病毒发生反应,证明这6个重组蛋白均具有较好的免疫原性。同时,ELISA和Western blotting结果还显示,3个灭活病毒免疫小鼠制备得到的抗血清也能与6个蛋白分别反应,即灭活病毒刺激机体产生的抗体能够与6个重组蛋白反应,这表明重组蛋白中的B表位也能够产生相应的抗体。抗体中和试验、血凝抑制(Hemagglutinationinhibition,HI)试验和快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)证明6个重组蛋白均能同时诱发小鼠产生针对CDV、CPV和RV的中和抗体。然而与CDV、CPV灭活病毒及RV的商业化疫苗组相比,6个重组蛋白产生的中和抗体的效价较低,具有明显的统计学差异。比较6个重组蛋白在小鼠中诱导产生中和抗体的效价,结果显示相对于其他4个蛋白,rP1和rP4能够产生更高效价的中和抗体,但rP1和rP4组之间无显著差异。为了研究不同佐剂对重组蛋白免疫增强效果的差异,本研究以rP4为免疫原分别与PEI佐剂、PEI + CpG佐剂、CpG佐剂、弗氏佐剂及铝佐剂配伍,免疫4周龄BALB/c雌性小鼠,以不加佐剂组为对照。在3免后第2、4、6和8周采血制备鼠源多抗血清。ELISA检测不同时期抗血清中特异性抗体的滴度,结果表明五种佐剂均能增强rP4诱导小鼠产生特异性抗体的能力与不使用佐剂组相比差异极显著。免疫增强效果为:弗氏佐剂PEI + CpGPEI铝佐剂CpG。各佐剂组特异性抗体均持续8周不消减,而不加佐剂组在第8周时降低。ELISA分别检测不同组3免后第2周抗血清中IgG1和IgG2a抗体亚型并计算其比值。通过比值分析可知,弗氏佐剂倾向于协助rP4诱导产生细胞免疫,铝佐剂倾向于协助rP4诱导产生体液免疫,而PEI倾向于诱导rP4产生平衡的体液免疫与细胞免疫,与CpG联用时,PEI协助rP4诱导的免疫反应向细胞免疫倾斜。综上所述,本课题首次成功构建、表达和纯化出了 6个含有CDV、CPV和RV病毒B细胞表位和T细胞表位的重组表位蛋白,这6个蛋白均具有良好的免疫原性,可同时诱导小鼠产生针对三种病毒的中和抗体。同时本研究还证明,PEI+CpG作为多表位重组蛋白的佐剂具有很强的免疫增强作用。上述研究结果为CDV、CPV和RV病毒多表位重组疫苗的研究奠定了坚实基础。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.655

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 石晓妮;窦永喜;才学鹏;;表位疫苗的研究进展[J];中国兽医科学;2011年04期

2 牛学锋;刘晓慧;孙招金;施赫赫;陈晶;江飙;孙京臣;郭霄峰;;表达犬细小病毒VP2蛋白的嵌合狂犬病病毒生物学特性的研究[J];病毒学报;2009年05期

3 李河林;焦铁军;刘淑红;王晶钰;李健强;;犬细小病毒病研究进展[J];动物医学进展;2008年05期

4 张有峰;王红宁;黄勇;阳泰;;多表位疫苗的构建策略及其在动物疫苗中的应用[J];中国农业科技导报;2008年02期

5 邱薇,夏咸柱,范泉水,王春华,黄耕,何洪彬,范秀军,乔军,余春,武银莲;犬细小病毒血凝抑制抗体和中和抗体的关系[J];中国兽医科技;2000年10期

6 江国托，，闫庆生，刘长明，卢景良;犬瘟热病毒的结构多肽分析[J];中国兽医杂志;1995年12期

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1 许云华;表达GPV VP3和CPV VP2结构蛋白重组乳酸乳球菌的构建[D];扬州大学;2008年

本文编号：1317769