基于转录组学分析研究印楝和苦楝中柠檬苦素类化合物的合成

发布时间：2017-12-23 17:20

本文关键词：基于转录组学分析研究印楝和苦楝中柠檬苦素类化合物的合成　出处：《中国林业科学研究院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：柠檬苦素类化合物是一类三萜类化合物,具有良好的生物学活性和生态学效应,能够有效杀灭小菜蛾、菜青虫、蝗虫等多种农业害虫,是一类理想的植物源杀虫剂。印楝和苦楝是两种楝科植物,在进化上具有较近的亲缘关系,化学成分分析表明二者均含有丰富的柠檬苦素类化合物,但种类和成分相差较大,尤其是在苦楝中基本检测不到印楝素。因此基于两种楝树体内柠檬苦素构成类型不同这一现象,本研究运用Illumina高通量测序技术对印楝和苦楝的叶片样本进行链特异性转录组测序,获得了大量的基因序列信息,然后对数据进行深入的生物信息学分析,如印楝的可变剪接分析、单核苷酸多态性和插入缺失位点预测、新基因挖掘、基因结构优化和表达量分析;苦楝的Unigenes编码区预测、简单重复序列分析和功能注释;两种楝树直系同源基因的比较分析等,并对获得的大量有效信息进行分析,进而筛选出柠檬苦素类化合物生物合成途径中涉及的多个相关基因,同时进行克隆和初步表达分析。主要研究结果如下:1.通过对三个印楝样本(Y1、Y2、Y3)分别提取总RNA、构建链特异性文库和高通量测序,获得23M、22M和28M的双端Reads。FastQC质检结果显示clean reads数占raw reads数的98.2%以上,测序碱基质量值Q30达到91.44%以上,这表明测序质量较好。基于印楝参考基因组信息,有超过81.26%的reads能比对到基因组上。Mapped reads采用Cufflink进行拼接,并将拼接结果与基因组注释结果进行比较,预测到约83,000种可变剪接情况,其中第一个和最后一个外显子可变剪接最为常见,占总事件的80%以上。同时通过比对分析修正优化了5037个基因结构并发现1179个新基因,其中1055个新基因功能被注释。通过基因表达量分析,大多数基因FPKM值在0.1-100之间,相关系数表明三个样本间重复性较好。此外通过GATK软件对Mapped Reads进行分析,挖掘了72,644个SNP位点和10,368个InDel位点。将这三个样本的转录组数据提交到NCBI SRA数据库中,获得了三个样本的登录号:Y1(SRR3180937)、Y2(SRR3181105)和Y3(SRR3181166)。2.同样地通过对三个苦楝样本(K1、K2、K3)的链特异性RNA-seq测序分析,分别获得约26M、23M和21M的双端reads。FastQC质检结果显示clean reads占raw reads的98%以上且测序碱基质量值Q30≥91.27%,测序质量较高。随后利用Trinity将clean reads进行从头组装,共得到6,014,722条contig、225,972条transcript和91,607条unigene序列,其n50值分别为48、2628和1321个碱基,组装完整性较好。利用bowtie软件将cleanreads比对到组装完的transcript和unigene库中,约93%以上的reads能匹配上,说明trinity组装效果较好。unigene潜在编码区预测采用transdecoder软件进行,共识别潜在的cds序列68,225条,其中25,574条序列读码框完整。随后利用misa软件对18,099条1kb以上的unigene做ssr分析,共识别含有ssr位点序列5521条,合计位点总数7338个。将unigene库与常见数据库进行比较分析,共有53,732条基因功能信息被注释。通过fpkm值分析unigene表达量,发现大多数基因fpkm值在0.1-100之间,且三个样本间重复性较好。同样将这三个样本的转录组数据提交到ncbisra数据库中,获得了相应的登录号:k1(srr3183379)、k2(srr3183380)和k3(srr3183381)。3.通过对两种楝树的蛋白序列进行同源比对,共筛选到3867对直系同源基因,随后对这些基因的表达量进行标准化并筛选表达量相差两倍以上的基因作为差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,degs),共选出2478个degs,其中在印楝中有1388个基因表现为上调,1090个基因表现为下调。将degs与常见数据库进行比对分析,共注释到2459个degs功能信息。kegg和topgo富集分析显示在印楝中71个显著上调基因涉及atp结合、链特异性dna结合、精氨酸/丝氨酸剪接因子、蛋白酪氨酸磷酸酶、去甲酰酶、异构酶和甲基转移酶等;281个显著下调基因涉及光裂合酶、解旋酶、n-乙酰基转移酶、琥珀酰转移酶和异戊烯基转移酶等。kegg注释完成后对印楝和苦楝中萜类合成相关基因进行筛选,在印楝中分别得到107、24、74和30条基因序列参与萜类骨架、单萜、二萜、倍半萜和三萜的生物合成过程,而苦楝中分别有135、29、50和27条unigenes参与了上述生物合成,同时涉及上述萜类合成过程的degs分别为6、2、3和1条。对12条萜类合成相关的degs进行进一步分析发现6条参与萜类骨架合成的基因在印楝中表达上调,说明印楝中总体萜类合成明显比苦楝活跃,这与化学成分分析中印楝总萜含量(2.45%)高于苦楝总萜含量(1.67%)相一致。而涉及单萜、二萜和三萜合成中的6条degs有5条在印楝中表达下调如β-香树精合成酶、薄荷醇脱氢酶、贝壳杉烯酸脱氢酶和赤霉素氧化酶,仅贝壳杉烯氧化酶基因表达上调。4.通过分子生物学技术成功克隆了26条柠檬苦素合成相关基因,其中印楝6条,分别为aidxr、aifpps、aihmgs、aihmgr、aiipi和aiss;苦楝20条,分别为madxr、MaHMGS、MaIDS、MaHMGR、MaATCC、MaMK、MaCMK、MaMDC、MaSS、MaDXS1、MaDXS2、MaHDS、MaMECPS、MaIPI、MaGGPPS1、MaGGPPS2、MaGGPPS3、MaSQLE1、MaSQLE2和MaGPPS。选取了印楝素合成的最近关键基因AiSS构建原核表达载体pET32a-AiSS并在Escherichia coli BL21(DE3)进行蛋白表达,结果发现表达蛋白以包涵体形式存在于沉淀组分中,随后构建真核表达载体pPICZαA-AiSS并在Pichia pastoris GS115进行表达,虽然成功筛选到阳性克隆,但未能在发酵液上清中获得表达蛋白,这可能是AiSS在N端有膜定位信号,在分泌到胞外的过程中被截留到膜上。对这26条基因的成功克隆不仅帮助我们了解楝树体内柠檬苦素的生物合成途径,还可以通过对其进行蛋白表达和功能分析,改造并筛选出高产鲨烯的工程菌,为今后柠檬苦素的规模化生产奠定基础。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.33

【参考文献】