RBSDV与SRBSDV病毒质蛋白P9-1结合单链RNA的结构与生化特性研究

发布时间：2017-12-24 23:16

  本文关键词：RBSDV与SRBSDV病毒质蛋白P9-1结合单链RNA的结构与生化特性研究　出处：《南京农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked ddwarf virus,RBSDV)及南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black streaked dwarf virus SRBSDV)在分类上同属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus),两种病毒的基因组均由10条dsRNA组成,基因组S9第一个开放阅读框架编码的非结构蛋白P9-1分子量大小均为40kDa,是病毒质蛋白。病毒质蛋白是组成病毒质的最小组分,而病毒质被认为是病毒复制组装的集中场所,包含病毒蛋白、病毒RNAs、外壳蛋白及不完整或完整的病毒颗粒。病毒质蛋白的表达受到破坏或抑制将导致病毒质无法形成,使病毒失去复制的场所,因此病毒质蛋白是病毒进行复制必需的蛋白,可以作为抗病研究的一个靶标因子。病毒质蛋白具有募集并结合基因组RNA复制产生dsRNA的特性,但是目前对这两个病毒P9-1蛋白在病毒质中的自身属性及其生物学特性尚不清楚,我们通过体外的生化实验深入了解RBSDV P9-1及SRBSDV P9-1结合单链RNA的结构与生物学特性。1 RBSDV病毒质蛋白P9-1结合单链RNA的结构与生化特性研究我们通过镍柱纯化方式在体外大量表达纯化RBSDV P9-1蛋白,用于蛋白结构及其与单链RNA结合生化特性的分析。琼脂糖胶凝胶阻滞及核酸竞争试验表明RBSDV P9-1优先结合单链核酸,但不具有结合特异性;P9-1蛋白与单链RNA发生结合会形成许多大小不同的中间复合物;非变性不连续梯度PAGE电泳及分子筛层析表明,RBSDVP9-1能形成一系列从低位体到高位体的多聚体蛋白构型,分别为二体、四体、八体等,其中二体是其主要多体状态;非变性不连续梯度PAGE电泳与凝胶阻滞实验分析显示RBSDV P9-1的八体结构是结合单链RNA的主要形式,据此我们提出八体结合模型;在原有报道的RBSDV P9-1晶体结构的基础上,对RBSDVP9-1 C端手臂序列缺失,发现突变体不再形成八体,而结合单链RNA的能力也受到影响;软件预测表明RBSDV P9-1存在两个结合RNA的结构域:25-44位残基与319-327位残基;氨基酸替换分析2544位氨基酸残基中带正电荷氨基酸是结合RNA的重要位点,并且影响蛋白八体结构的形成,25-44位氨基酸残基定位于八体晶体结构的中心孔结构。本研究为呼肠孤病毒属家族中的其他病毒的病毒质蛋白结构与生化功能研究提供了崭新的视角。2 SRBSDV病毒质蛋白P9-1结合单链RNA的结构与生化特性研究SRBSDVP9-1蛋白与RBSDVP9-1的同源性为77%,但是前人研究表明SRBSDV形成一种新型的病毒质,因此本研究对其进行了蛋白结构与生化特性的初探。我们在体外大量表达带His标签的SRBSDV P9-1用于分析蛋白的生化特征分析。镍柱纯化回收的蛋白在4-16%非变性PAGE胶上形成一系列多聚体蛋白形态,在自然状态下,分别聚合形成二体、四体、六体、八体,但与RBSDVP9-1不同的是,SRBSDVP9-1蛋白以高聚体(如八体)为主要存在形式;凝胶阻滞实验分析显示,SRBSDV P9-1具有结合单链RNA的活性,且以八体结构为主要结合形式;SRBSDV P9-1蛋白的C端对八体的形成也具有重要作用,C端23个氨基酸的缺失导致八体不再形成,并且其结合RNA的能力受到影响;丙氨酸替换试验表明SRBSDVP9-1氨基端R26、R39、K43、K44这四个带正电的氨基酸是主要的RNA结合位点,这四个位点突变后几乎丧失结合单链RNA的能力,并且突变体只形成少量八体;氨基酸序列比对,SRBSDV P9-1与RBSDV P9-1差异存在于131-160位残基序列,将SRBSDV P9-1的该段残基置换到RBSDVP9-1相对应的区域非但没有增加八体,反而影响RBSDVP9-1八体结构的形成,同时结合单链RNA的能力减弱,该结果表明仅有RNA结合位点但不具备八体构象将不能有效结合单链RNA,因此蛋白构象与结合位点共同决定蛋白结合RNA的能力,当两者完全匹配时,蛋白结合RNA的活性将达到最大。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.11

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本文编号：1330370