杜仲种仁转录组测序及FAD3基因的鉴定与功能研究

发布时间：2017-12-25 12:14

  本文关键词：杜仲种仁转录组测序及FAD3基因的鉴定与功能研究　出处：《中国林业科学研究院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)为单科单属单种植物,是我国特有的重要经济树种和名贵的药用植物。杜仲适应性强,且广泛分布于我国北纬27°-42°间的27个省市。杜仲种子的含油率为30%左右,其籽油中含有丰富的α-亚麻酸,含量可高达62%。研究表明FAD3是直接催化亚油酸生成α-亚麻酸的关键基因,因此研究EuFAD3基因对探索杜仲种仁中α-亚麻酸合成和高效积累的分子机制以及杜仲的定向遗传改良具有重要意义。本研究分别以‘华仲6号’和‘华仲10号’花后70 d和160 d的种仁为材料进行转录组测序分析,在此基础上展开了对EuFAD3基因的结构、表达模式、亚细胞定位以及功能等方面的系统研究,主要研究结果如下:1.利用新一代高通量测序技术Illumina HiSeqTM 2000分别对杜仲国审良种‘华仲6号’和‘华仲10号’花后70 d、160 d的种仁共4个样本进行转录组测序分析,共得到72,791,399个高质量的序列读取片段(clean reads),包含了14,702,548,161个(14.70 G)的碱基序列(bp)信息。对reads进行序列组装,共获得96,469个平均长度为690 bp的单基因簇(Unigene),序列信息量达到了66.56 Mb。转录组数据的各项指标均表明测序质量较好,且可信度较高。(1)同源性分析结果显示,有49,856个与其它物种同源的Unigenes得到注释,占All-Unigene的51.68%;(2)将杜仲转录组中的Unigene与GO数据库进行比对分析,根据其功能可将注释到的38,983条Unigene分成3大类(细胞组分、分子功能和生物学过程)56个分支;(3)根据COG功能可将注释的14,796条Unigene基因划分成25个类别;(4)KEGG数据库作为参照,可将注释到的11,260条Unigene定位到117个代谢途径分支;(5)SSR位点搜索结果显示,96,469个Unigene中共包含9,621个完整型SSR位点,占总SSR位点的84.14%。完整型SSR位点共包含55种重复基元,其中出现频率最高的重复基序类型为单核苷酸重复中的A/T(4,597个),其次是AG/CT(2,597个)、AT/AT(439个);本研究首次对杜仲种仁的转录组进行了测序分析,这些注释信息为杜仲种仁发育过程中相关功能基因的研究提供了重要的依据和理论参考。2.结合转录组数据和RACE技术共克隆得到2个FAD3基因,其全长cDNA序列、基因组DNA序列以及启动子信息如下:(1)EuFAD3-1基因的全长cDNA序列为1,281 bp,共编码426个氨基酸,氨基酸的分子量为49.18 kDa,等电点为7.43;EuFAD3-1基因组DNA序列的长度为3,151 bp,含有8个内含子和9个外显子;已克隆到EuFAD3-1基因的启动子长度为2,038 bp;(2)EuFAD3-2基因的全长cDNA序列为1,347 bp,共编码448个氨基酸,氨基酸的分子量为50.92 kDa,等电点为9.01;EuFAD3-2基因组DNA序列的长度为1,347 bp,无内含子;已克隆到EuFAD3-2基因的启动子长度为2,201 bp。3.以杜仲Actin为内参基因,利用荧光定量PCR技术研究FAD3基因分别在‘华仲6号’和‘华仲10号’种仁发育不同时期中的表达模式:(1)EuFAD3-1基因在‘华仲6号’和‘华仲10号’种仁发育过程中均是先上升后下降,并分别在花后110 d和150 d达到最大值;(2)FAD3-2基因在‘华仲6号’种仁发育过程中先上升后下降,最后又上升,并在花后110 d达到最大值;FAD3-2基因在‘华仲10号’种仁发育过程中先下降后上升至最大值(花后100 d),最后又下降。4.根据已克隆出来的两个FAD3基因全长cDNA序列设计特异引物,利用pDNOR222.1载体和含有YFP荧光蛋白的表达载体(nYFP-CD3 686)构建含有目的基因的融合表达载体,电击法转化到根癌农杆菌GV3101中,并注射到野生型小叶烟草的叶片中,在LSM510激光共聚焦显微镜下用Marker共定位后,观察目的基因的亚细胞定位情况。结果表明,杜仲两个FAD3基因均定位于内质网。5.采用DNA重组技术成功构建了pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1和pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-2两个植物超表达载体,电击法转化到农杆菌GV3101中,叶盘法侵染烟草叶片并用抗生素筛选阳性植株。以阳性烟草植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增和GUS染色两种方法鉴定阳性植株,分别得到30株和36株转基因烟草阳性株/系,分别选取其中的9个株/系的成熟种子通过高效气相色谱法进行脂肪酸成分分析,结果显示,相对对照(野生型)而言,pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1和pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-2转化系的烟草种子中α-亚麻酸的含量分别增加了4.27%和0.92%,而亚油酸的含量分别降低了3.86%和0.65%,其他脂肪酸成分变化不显著。pCAMBIA1304-35s-EuFAD3-1转基因烟草种子中α-亚麻酸的含量要远远高于FAD3-2的。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S792.99

【参考文献】

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本文编号：1332781