莱氏野村菌侵染相关基因的筛

发布时间：2017-12-26 00:21

  本文关键词：莱氏野村菌侵染相关基因的筛选、遗传转化体系的建立及基因功能鉴定　出处：《重庆大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：莱氏野村菌[Nomuraea rileyi(Farlow)Samson]是一种重要的昆虫病原真菌,在田间可以自然感染多种鳞翅目害虫,引起害虫域内流行病,在生物防治中起到重要的作用,具有潜在的生物农药应用前景。但莱氏野村菌杀虫剂也存在防效缓慢、易受到环境因素的制约和干扰、产品有效期短、质量稳定性较差等缺点。因此通过基因工程的手段,利用有效的杀虫靶标对原有菌株进行改良,构建高效安全而且环境友好的的杀虫工程菌已成为当前该领域研究的重中之重。而作为实现该目标的前期工作基础,寻找有效杀虫靶标、研究莱氏野村菌侵染害虫的分子机制以及真菌侵染与害虫免疫的互作关系、探明杀虫机理,无论是在阐明莱氏野村菌抵御害虫免疫机制的基础理论研究方面,还是在杀虫靶标基因的现实应用方面都有着重要的意义。论文以研究莱氏野村菌侵染夜蛾科害虫斜纹夜蛾的分子机理,并提高莱氏野村菌的生防效果为主要目的,尝试多种方法和途径展开研究。取得的研究结果如下:(1)莱氏野村菌注射侵染斜纹夜蛾血淋巴后,分离获得处于不同发育时期的虫菌体,利用DD-RT-PCR差异显示技术,共获得42条差异表达的片段。BlastX比对分析并结合转录组分析结果表明,克隆EST片段大小在47-542 bp之间,获得的差异EST片段涉及真菌抵御昆虫免疫系统、抗氧化、逃避宿主免疫、电子传递、细胞周期控制、压力反应、砷酸盐还原、过氧化物膜蛋白、信号转导、脂肪酸脱氢酶等功能基因。利用qPCR的方法验证了各差异基因在不同时期的表达情况。定量PCR结果表明,差异显示中基因表达变化并不完全与qPCR检测到的基因表达变化相同。(2)本论文采用3种方法获得目标基因的全长序列:利用RACE技术扩增差异表达基因的全长;利用FPNI-PCR的方法,以gDNA为模板,迅速扩增差异表达基因片段的上下游序列;另外通过本地BLAST的方法,在转录组测序库中比对得到cDNA序列。利用此类方法获得了SR-RCI,PI-PLC,MCL1,NrFADS2等基因的cDNA全长、gDNA序列和上下游序列。本论文重点研究了莱氏野村菌感染斜纹夜蛾后显著上调表达的脂肪酸脱氢酶NrFADS2基因。基因序列分析表明,该基因序列中含有三个内含子,开放阅读框由1758 bp组成。NrFADS2基因编码585个氨基酸组成的蛋白,含有membrane-FADs-like超家族蛋白保守的结构域,包括N端的Cyt-b5结构域和HPGG保守区域,以及中间区域和C末端的delta6-FADs-like结构域。定量PCR试验表明,NrFADS2基因在莱氏野村菌侵染斜纹夜蛾血淋巴的不同阶段诱导表达。(3)遗传转化体系的建立是基因功能研究的重要前提,利用莱氏野村菌芽生孢子作为遗传转化的受体细胞,对转化体系统的各种参数进行了优化,筛选出了培养基中潮霉素的最适筛选浓度为450μg/m L,优化了诱导剂乙酰丁香酮最适诱导浓度为200μM;对比了AGL-1,LBA4404,GV3101,C58等不同农杆菌菌株对CQNr01菌株转化效率,发现农杆菌菌株GV3101具最高转化效率;构建了随机插入载体pPZP-Ptrpc-Hph和pPZP-Hph-DsRED2,第一次利用农杆菌介导的方法成功将潮霉素抗性基因和红色荧光蛋白导入莱氏野村菌CQNr01芽生孢子中,PCR和Southern杂交结果表明,目标基因已成功整合到莱氏野村菌基因组中,建立了农杆菌介导的莱氏野村菌的遗传转化体系。(4)利用随机插入载体pPZP-Ptrpc-Hph和pPZP-Ptrpc-Hph-DsRED2,以农杆菌介导转化莱氏野村菌,构建了农杆菌介导的莱氏野村菌的随机插入突变体库,获得了丰富的突变子表型,并利用FPNI-PCR获得了突变子插入位点的侧翼序列,此方法对于当前没有明确基因组信息的莱氏野村菌来说,可以从丰富的表型变化来研究基因的功能,打开了莱氏野村菌正向遗传学研究的大门。(5)在莱氏野村菌没有基因组序列背景的条件下,利用FPNI-PCR法迅速扩增目标基因的侧翼序列,构建了敲除载体,通过农杆菌介导,成功实现了目标基因的定点替换性敲除,建立了莱氏野村菌的基因敲除突变体系。(6)目标基因功能的鉴定离不开基因的回复体系。本论文利用FPNI-PCR的方法克隆了目标基因的启动子序列,将启动子和ORF序列插入回复载体,构建成基因回复载体;利用诺尔斯菌素抗性基因Sat1基因作为回复筛选的标记基因,最终确立诺尔斯菌素的最适抑菌浓度为300μg/m L。(7)初步鉴定了野生型菌株、敲除菌株和回复菌株之间生理生化的变化和对斜纹夜蛾毒力的变化。研究结果表明,敲除NrFADS2基因影响菌株对脂肪酸的利用能力,降低了菌株抗氧化能力,影响了敲除菌株的细胞壁组成的完整性,但对于维持细胞渗透压的稳定性并没有直接影响。敲除NrFADS2基因后,影响莱氏野村菌对斜纹夜蛾体表侵染的毒力,但不影响虫菌体体内增殖能力,推断该基因主要在侵染寄主表皮阶段起作用。敲除NrFADS2基因影响莱氏野村菌的抗紫外线能力,该基因可能参与细胞膜光损伤的修复。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.12
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本文编号：1335075