桔小实蝇Tachykinin和Natalisin信号系统的生理功能及其药靶潜力评估

发布时间：2017-12-30 12:49

本文关键词：桔小实蝇Tachykinin和Natalisin信号系统的生理功能及其药靶潜力评估　出处：《西南大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：桔小实蝇是重要的农业害虫,由于寄主范围广、适应能力强以及抗药性发展快速等因素,对其持续防控愈发困难。神经肽是昆虫体内一种重要的信号分子,通过激活G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)调控昆虫多种生理功能,阻断或扰乱神经肽信号系统的信号传导,能够达到控制害虫的目的。因此,神经肽信号系统被认为是一种理想的杀虫剂靶标。本学位论文基于桔小实蝇基因组和中枢神经系统(Central nervous system)转录组数据,利用生物信息学方法,对桔小实蝇神经肽前体基因进行鉴定及注释;克隆获得2个近似神经肽Tachykinin(Tachykinin related-peptide,TRP)和Natalisin(NTL)前体及其受体基因的cDNA序列,并解析了桔小实蝇TRP(BdTRP)和NTL(BdNTL)及其受体(BdTRPR和BdNTLR)基因结构信息;采用实时定量PCR(qPCR)技术,分析BdTRP和BdNTL及其受体在桔小实蝇体内的时空表达模式;运用免疫组化(Immunohistochemistry)和荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization)技术,定位桔小实蝇脑部表达BdTRP和BdNTL的神经元;通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)、触角电位(Electroantennogram,EAG)以及行为学分析技术和方法,确定桔小实蝇TRP和NTL信号系统承担的具体生理功能;利用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统及胞内钙离子流动测定技术,分别对BdTRPR和BdNTLR进行功能性测定及药理学分析,并以此建立靶向BdTRPR和BdNTLR的激动剂和拮抗剂的高通量筛选平台;最后,利用该筛选平台对13个神经肽类似物进行了靶向活性筛选和评价。本论文主要研究结果如下:1桔小实蝇神经肽前体基因的鉴定及注释基于桔小实蝇基因组和中枢神经系统转录组数据,鉴定及注释了39个桔小实蝇的神经肽前体基因。序列分析结果发现,桔小实蝇大多数神经肽前体具有典型的结构特征,即“信号肽+成熟肽+前体相关肽”;成熟肽的切割位点保守,一般为赖氨酸残基(K)和精氨酸残基(R)组合;大多数成熟肽C端具有酰胺化修饰位点。此外,Adipokinetic hormone、Allatostatin C(AST-C)、Corazonin和Diuretic hormone 44成熟肽的N端存在谷氨酸环化形成的焦谷氨酸;AST-C、Allatostatin CC(AST-CC)、Crustacean cardioactive peptide、CCHamide、CNMamide、Insulin-like peptide和Neuroparsin成熟肽的半胱氨酸之间存在二硫键;Sulfakinin成熟肽具有1个硫酸化的酪氨酸;CNMamide、Ion transport peptide和Orcokinin的前体基因存在选择性剪接现象;神经肽Neuropeptide F存在基因复制现象。利用巢氏PCR技术,克隆获得了桔小实蝇BdTRP和BdNTL前体基因以及相应受体基因的cdna序列。序列分析结果表明bdtrp和bdntl前体均具有神经肽保守的结构特征,其中bdtrp前体含有5个成熟肽。除bdtrp5外,其余4个成熟肽序列均具有昆虫trp保守的基序fxgxramide。bdntl前体含有3个成熟肽,成熟肽序列均具有昆虫ntl保守基序fxxxramide,与trp基序具有一定的相似性。此外,bdtrpr和bdntlr均有7个跨膜结构域,为典型的g蛋白偶联受体,且与其它昆虫相应受体序列相比,跨膜结构域序列高度保守。系统发育分析结果表明,节肢动物trpr和ntlr明显聚为两个分支。2桔小实蝇trp信号系统的功能研究利用qpcr技术解析桔小实蝇bdtrp和bdtrpr的时空表达模式。结果表明,bdtrp和bdtrpr均在桔小实蝇的成虫期表达水平相对较高,在幼虫和蛹期的表达水平相对较低;值得注意的是,卵期bdtrpr的表达水平最高,而bdtrp的表达水平相对较低。桔小实蝇bdtrp和bdtrpr组织特异性的表达模式分析结果表明,bdtrp主要在桔小实蝇中枢神经系统和中肠高水平表达,而其受体bdtrpr在成虫组织中的表达较为广泛,在中枢神经系统、中肠、后肠及触角均能检测到表达。利用免疫组化和荧光原位杂交技术,分别在蛋白和mrna水平对桔小实蝇成虫脑部分泌bdtrp的神经元进行定位分析。免疫组化分析结果显示,在蛋白水平,桔小实蝇成虫脑部有多对神经元分泌bdtrp。在前脑区域,背外侧中间神经元(dorsolateralinterneuron,dli)和前脑后部背外侧神经元(posteriordorsolateralprotocerebrumneuron,pdlp)各有1对神经元分泌bdtrp。在后脑区域,有1对后脑神经元簇分泌bdtrp。在咽下神经节区域,有1对神经元分泌bdtrp。此外,在前脑中上部区域发现大量被荧光标记的神经纤维。与此同时,桔小实蝇脑部触角神经叶外侧有9对局部中间神经元(localinterneuron,ln)分泌bdtrp。原位杂交分析结果发现,在mrna水平标记到表达bdtrp的神经元少于免疫组化分析中定位的神经元,分别有1对dli和2对前脑背外侧神经元(dorsolateralprotocerebrumneuron,dlp)表达bdtrp。值得一提的是,在ln发现有bdtrp表达,这与免疫组化分析结果相对应。此外,bdtrp在桔小实蝇幼虫脑部免疫组化分析结果显示,桔小实蝇幼虫的脑部有4对神经元分泌bdtrp,而荧光原位杂交分析结果显示,仅1对神经元表达bdtrp。利用rnai、eag以及y型管行为分析技术和方法,研究trp信号系统对桔小实蝇嗅觉敏感性的影响。结果发现,注射dsrna能够有效干扰靶基因的表达水平,靶基因沉默效率介于62.3-68.4%。eag分析结果表明,在干扰bdtrp或bdtrpr的表达后,桔小实蝇成虫对10%乙酸乙酯的eag反应均显著低于对照。y型管行为分析结果表明,对照组桔小实蝇成虫对10%乙酸乙酯的反应表现为排斥,而干扰bdtrp或bdtrpr的表达后桔小实蝇成虫对10%乙酸乙酯的反应由排斥转变为随机选择。由此可见,trp信号系统能够调控桔小实蝇的嗅觉敏感性,说明该神经肽信号系统具有显著的控制剂靶标潜力。3桔小实蝇ntl信号系统的功能研究利用qpcr技术解析桔小实蝇bdntl和bdntlr的时空表达模式。结果表明,bdntl和bdntlr均在蛹和成虫期的表达水平相对较高,在幼虫期的表达水平相对较低,卵期bdntl的表达水平最高,而其受体bdntlr的表达水平则较低。桔小实蝇bdtrp和bdtrpr组织特异性的表达模式分析结果表明,bdntl主要在中枢神经系统高水平表达,而其受体bdntlr除在中枢神经系统表达外,在后肠、触角、卵巢和精巢也有一定的表达水平。利用免疫组化和荧光原位杂交技术,分别在蛋白和mrna水平对桔小实蝇成虫脑部分泌bdntl的神经元进行定位分析。免疫组化分析结果显示,在蛋白水平,桔小实蝇成虫的脑部有13对神经元分泌bdntl。其中,dlp和前脑间部小神经元各有2对神经元分泌bdntl,pdlp有7对神经元分泌bdntl。此外,在前背外侧中间神经元(anteriordorsolateralinterneuron,adli)和下对侧中间神经元(inferiorcontralateralinterneuron,icli)各有1对神经元分泌bdntl。荧光原位杂交结果显示,在mrna水平,发现在dlp、adli和icli各有1对神经元表达bdntl。在幼虫脑部表达bdntl的神经元较少,免疫组化分析结果显示,在幼虫脑部有6对神经元分泌bdntl,而荧光原位杂交分析结果显示幼虫脑部仅有2对神经元表达bdntl。利用rnai技术,研究ntl信号系统对桔小实蝇交配率、产卵量以及卵巢和精巢发育的影响。结果发现,注射dsrna能够有效干扰靶基因的表达水平,靶基因沉默效率介于51.0-81.6%。桔小实蝇雌虫或雄虫经dsrna-ntl处理后,其交配率均显著降低。但是,雌虫产卵量以及卵巢或精巢的发育程度并未受到明显影响。对其受体bdntlr进行有效干扰后,桔小实蝇成虫的交配率同样显著降低。综上所述,ntl信号系统对桔小实蝇产卵量以及卵巢或精巢的发育并无明显影响,但能够影响桔小实蝇成虫的交配率,说明该神经肽信号系统亦具有显著的控制剂靶标潜力。4桔小实蝇trpr与ntlr受体的激动剂和拮抗剂筛选利用cho细胞表达系统实现对桔小实蝇trp和ntl受体的功能性表达,采用细胞内钙离子流动测定的方法建立两个受体的功能测定体系。利用该技术体系,测定了TRP和NTL受体各自内源配体的有效中浓度(50%effective concentration,EC50),并以此确定各自的模式配体。结果显示,BdTRP5为BdTRPR的模式配体,BdNTL2为BdNTLR的模式配体。活性测定结果表明,BdNTL2能在1μM浓度下完全激活BdTRPR,而同样浓度的BdTRP5也能完全激活BdNTLR,说明在离体条件下,两个信号系统间存在交互效应。进一步利用该技术体系搭建靶向BdTRPR和BdNTLR的激动剂和拮抗剂的高通量筛选平台,对13个NTL/TRP类似物进行激动剂和拮抗剂活性测定。结果表明,13个化合物均无靶向BdNTLR的有效激动剂或拮抗剂的活性。化合物1888[Φ1]wp-4和2120[Φ1]wp-1具有明显的靶向BdTRPR的激动剂活性,且对BdTRPR的激活能力呈浓度依赖性关系,EC50值分别为4.9 nM和268.8 nM。化合物1887[Φ1]wp-3具有靶向BdTRPR的中度拮抗活性,且拮抗活性呈浓度依赖性关系,抑制中浓度(50%inhibitory concentration)为0.57μM。综合分析,本学位论文研究成果不仅丰富了昆虫神经肽的信息,促进了神经肽信号系统对昆虫行为调控的神经生理学机制的理解,还为靶向神经肽信号系统的新型控制剂的创制提供了理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433

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