细胞microRNA以及病毒小分子RNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的作用机制

发布时间：2018-01-02 20:25

本文关键词：细胞microRNA以及病毒小分子RNA抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的作用机制　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种严重危害世界养猪业的病毒性传染病,主要临床症状为各年龄阶段猪呼吸道系统疾病和妊娠母猪流产、死产、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍。PRRSV属于尼多病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的单股正链RNA病毒。自从2006年高致病性PRRSV毒株(HP-PRRSV)所引起以高致病性、高死亡率为特征的高致病性PRRS在我国暴发以来,HP-PRRSV与低致病性PRRSV毒株(N-PRRSV)处于长期共存状态,传统疫苗对其保护力度不足,迄今对该病仍无确实有效的防制措施,新型抗病毒策略的研究开发对于PRRSV防控具有重要的意义。PRRSV具有严格的细胞嗜性,这一特性主要是由宿主细胞特异性表达病毒感染所需的受体蛋白决定的。然而研究证实,PRRSV也能够在一些非易感细胞中完成复制增殖,提示了可能存在已报道受体以外的其他蛋白参与病毒的感染过程。最新的研究发现,非肌肉型肌球蛋白II型重链A(Nonmuscle myosin heavy chain-IIA,MYH9)参与了PRRSV感染和病毒粒子运输的过程,通过形成类似于纳米管的细胞间连接能够将病毒粒子从感染的细胞运送至其他细胞中,有利于PRRSV逃避宿主的免疫防御。课题组前期研究发现在PRRSV与细胞表面受体发生相互作用后,MYH9引导病毒粒子脱衣壳以及病毒基因组的释放过程,是PRRSV感染不可或缺的重要分子。但是在病毒感染进程中病毒或宿主细胞对于MYH9的调控机制目前尚不清楚,仍需要进一步研究探索。microRNAs是一类内源性表达的小分子非编码RNA,通过mRNA降解或者抑制翻译等途径在转录后水平调控基因的表达。研究表明由宿主或者病毒编码的microRNA作为重要的调节因子参与了病毒感染过程中宿主及病毒基因的表达调控,在机体免疫应答和病毒与宿主相互作用的复杂网络中发挥极其重要的作用。一方面,病毒感染能够引起宿主编码的microRNA表达水平改变,后者通过靶向病毒或者自身的基因,对病毒生命过程的诸多环节进行调控,发挥抗病毒免疫应答或者被病毒利用反而利于病毒持续感染。另一方面,许多病毒同样可以编码microRNA调节病毒及宿主基因的表达,进而调控自身感染增殖的生命进程。在DNA病毒中已经发现了大量的病毒编码的microRNA,但关于RNA病毒所编码的microRNA报道较少,由于其生物学加工机制和调控病毒感染的方式与传统报道存在差异,目前往往将其归类于病毒小分子RNA(vsRNAs)。PRRSV作为一种有囊膜的单股正链rna病毒,对于prrsv能否编码病毒micrornas/vsrnas进而调控自身的感染目前还不清楚,需要进一步的研究探索。本课题研究内容和结果如下:1.细胞micrornalet-7f-5p通过靶向myh9抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肺泡巨噬细胞中的复制本研究首先利用生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因检测系统鉴定,发现myh9能够被细胞micrornalet-7f-5p所调控,并揭示了let-7f-5p通过特异性结合于myh93’utr,而发挥对myh9的转录后调控作用。其次利用let-7f-5p模拟物和抑制物转染pams,检测myh9的表达变化,证实了let-7f-5p调控myh9表达是同时以mrna降解和抑制蛋白翻译两种途径调控myh9表达。然后,通过基于茎环引物的实时定量pcr方法,检测了不同毒力prrvs感染的pams中let-7f-5p的动态变化规律,我们发现let-7f-5p在prrsv感染后表达水平显著下调,其靶基因myh9的表达存在上调趋势。最后,研究证明了宿主细胞micrornalet-7f-5p能够通过靶向myh9有效抑制不同毒力prrsv在pams中的复制,利用let-7f-5p过表达的技术能够有效的防控prrsv的感染,此研究为利用宿主细胞的microrna防控prrsv的感染提供了实验依据。2.prrsv编码的病毒小分子rna通过靶向nsp2抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒在猪肺泡巨噬细胞中的复制本研究首先发现所预测的四个具有典型茎环结构的vsrnas前体分别位于prrsv基因组的orf1a,orf1b以及gp2a区域。其中,prrsv-vsrna1前体具有最低的自由能(mfe)代表其能够形成较为稳定的二级结构,由此选择prrsv-vsrna1进行深入研究。利用northernblot及小rna克隆测序的方法,证实了在prrsv感染的pams中prrsv-vsrna1的存在。其次利用基于茎环引物的实时定量pcr方法检测prrsv-vsrna1在prrsv感染周期中的动态变化,我们发现prrsv-vsrna1的表达存在与prrsv感染进程相一致的趋势。为了探索prrsv-vsrna1所发挥的生物学功能,我们分别利用人工合成的prrsv-vsrna1抑制物和模拟物转染prrsv易感细胞后进行病毒感染检测,发现转染其抑制物能够显著促进prrsv在pams中的复制,而转染其模拟物能够显著抑制prrsv在pams中的复制。然后通过对microrna通路中关键蛋白的基因敲低试验,证实了prrsv-vsrna1的生物学加工过程依赖两种细胞蛋白drosha和ago2,而不依赖dicer和rnasel的参与。最后,利用生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因检测系统,我们鉴定了prrsv-vsrna1发挥调控作用的靶基因,发现prrsv-vsrna1能够特异性地结合到prrsv基因组中非结构蛋白2(nsp2)区域,从而抑制prrsv的感染,此研究为利用源于病毒的小分子rna防控prrsv的感染提供了实验依据。综上所述,本研究一方面从宿主的角度证实了细胞内源性micrornalet-7f-5p能够在转录后水平调节宿主细胞myh9基因的表达,从而在prrsv的感染过程中发挥重要作用;另一方面从病毒的角度出发,发现并证实了源于PRRSV基因组的PRRSV-vsRNA1能够靶向PRRSV的NSP2基因而负调控PRRSV的感染进程。揭示了PRRSV能够利用microRNA的调节机制在感染过程中调节宿主及病毒基因的表达,进而调控病毒的复制和增殖。过表达let-7f-5p与PRRSV-vsRNA1则分别通过抑制宿主的MYH9基因以及病毒的NSP2的表达从而发挥抗病毒作用。本研究为深入了解PRRSV感染过程中microRNA介导的病毒与宿主的相互作用以及细胞microRNA和源于病毒的vsRNAs在PRRSV防控中的作用,提供了全新的视角和策略。
[Abstract]:Porcine reproductive and respiratory syndrome ( PRRS ) is a kind of viral infectious disease caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus ( PRRS ) . In order to explore the biological functions of prrsv - vsrna1 , prrsv - vsrna1 can be effectively inhibited by prrsv - vsrna1 .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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