葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究

发布时间：2018-01-09 09:09

本文关键词：葡萄茎尖超低温保存及超低温疗法脱毒研究　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：葡萄(Vitis)是世界范围内最具经济价值的果树之一,城市化、工业化、土壤盐碱化和沙漠化等原因导致葡萄许多野生种与栽培种濒临灭绝。建立高效、简易的种质资源长期保存技术能有效地保护种质资源的多样性。超低温保存是目前植物种质资源长期保存最为理想的方法。病毒病是制约葡萄与葡萄酒产业发展的主要因素之一。栽培无毒苗是生产上防治病毒病害最为有效的措施。生产无毒苗是栽培无毒苗的核心技术。近年来建立的超低温疗法,为葡萄无毒苗生产提供了一种新技术。本研究以葡萄(Vitis)试管苗为试材,建立了茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系,为葡萄种植资源超低温库的建立提供了高效、广谱的超低温保存方法。建立了超低温疗法,有效的脱除了葡萄卷叶相关病毒-3(Grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3),为葡萄脱毒苗的生产提供了核心技术。同时,试管指示植物法、微样直接RT-PCR、免疫组织化学定位病毒检测为脱毒和病毒检疫提供技术支撑。本研究主要结果如下:1.通过优化影响葡萄茎尖超低温保存的关键因素,建立了简易、高效、光谱的葡萄茎尖小滴-玻璃化法超低温保存体系。含5-6片叶原基的腋芽(尺寸约1.0 mm)取自8周苗龄欧洲葡萄‘赤霞珠’(Vitis vinifera‘Cabernet Sauvignon’)试管苗,在预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸,pH=5.7)上暗培养3 d。加载液(2 M甘油+0.4 M蔗糖)常温处理20 min,再用1/2浓度植物玻璃化溶液(PVS2)和全浓度PVS2冰上分别处理30 min和25-50 min,然后将茎尖放置于铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中,直接投入液氮中保存。保存后的携带茎尖的铝箔条迅速转移到卸载液(1.2 M蔗糖)中常温解冻20 min,培养于含0.6 M蔗糖的恢复培养基中恢复24 h。再将茎尖转移至再生培养基中获得再生植株。再生培养基含1/2 MS+0.5 mg L-1 BA+7 g L-1琼脂,培养6周后可获得正常发育的植株。将该技术应用于其他7个葡萄基因型,包括5个欧洲葡萄和2个华东葡萄(V.pseudoreticulata),获得50.5%的平均再生率。再生率最高的是‘赤霞珠’(71.7%),最低的是‘白河35-1’(V.pseudoreticulata‘Baihe 35-1’,21.7%)。谷胱甘肽和抗坏血酸加入预培养基,解决了超低温保存后不再生的问题。比较腋芽着生部位和芽的类型对超低温保存再生率的影响,发现对于葡萄,腋芽比顶芽更适合用于超低温保存。通过组织学定位观察成活细胞的分布和数目探究PVS2处理不同时间对超低温保存成活率和再生率的影响,揭示超低温保存的茎尖成活模式。ISSR(inter-simple sequence repeat,内部简单序列重复)和RAPD(random amplification of polymorphic DNA,随机扩增片段长度多态性)技术用于检测葡萄茎尖超低温保存后得到的再生植株的遗传稳定性,未发现异常条带。超低温保存后的再生苗经过7次继代培养,其营养生长逐渐优于普通组培苗。2.建立茎尖小滴-玻璃化法超低温疗法以脱除GLRaV-3。从6周苗龄的‘赤霞珠’试管苗上取包含1个腋芽的单茎段,每个单茎段长约1.0 cm,培养于1/2 MS培养基中促进顶芽萌发。2周后,取顶芽(1.0 mm,含5-6片叶原基),置于预培养基(0.3 M蔗糖+0.16μM还原型谷胱甘肽+0.14μM L-抗坏血酸的)上暗培养3 d。用加载液常温处理20 min,再用1/2 PVS2冰上处理30 min,之后在PVS2中处理不同75 min。然后将茎尖转移至铝箔条上的PVS2小滴(2.5μL)中,直接投入液氮中。处理后的茎尖用卸载液常温处理20 min,培养于恢复培养基中恢复24 h。再将茎尖转移至再生培养基中培养6周后可获得正常发育的脱毒苗。超低温疗法对GLRa V-3的脱毒率为100%,茎尖大小或PVS2处理时间不影响脱毒率。利用免疫组织化学法观察GLRaV-3在茎尖中的分布,GLRaV-3在顶端分生组织和第1-4片叶原基没有分布,在距离顶端分生组织约0.2 mm处和第5片叶原基及更老组织有分布。超低温疗法后,第5片叶原基的细胞全部死亡。超低温疗法处理后的茎尖成活细胞分布,结合病毒定位结果,解释了超低温疗法能够脱除GLRaV-3的原因。3.优化、建立了微样直接RT-PCR(microtissue direct RT-PCR)法、免疫组织化学定位、试管指示植物和微嫁接四种技术对GLRaV-3进行检测和定位。以欧洲葡萄‘赤霞珠’为试材检测GLRaV-3时,微样直接RT-PCR使用注射针刺穿植株叶片或茎段,将针头剪断,置于反转录反应混合物PCR管中,加盖等待15 min,然后进行PCR扩增。该方法成功的应用到超低温疗法脱除GLRaV-3的脱毒苗检测,与RT-PCR检测结果比较,没有差异。免疫组织化学法定位GLRa V-3在组织中的分布,并成功的应用到葡萄茎段、茎尖组织的GLRa V-3定位,进一步证实GLRa V-3是维管束限制性病毒,并且不能够侵染到顶端分生组织和幼嫩的第1-4片叶原基。试管指示植物法,将感染GLRaV-3的试管苗茎段(约3 cm长,带2-3片叶)培养在含150 mM NaCl胁迫培养基中,最早在5 d即可观察到典型的卷叶病症状:叶片红色、叶缘向内卷曲,培养4周时有86%的症状显示比例。将其应用到其他三个基因型上,150 mM NaCl在杂交砧木‘6-12-2’(V.pseudoreticulata‘Baihe-35-1’×V.vinifera‘Carinena’)上显示症状最早,为4d,4周时症状占比为100%;在‘巨峰’显示症状最晚最轻,为8 d,显示症状占比为70%。
[Abstract]:Grape ( grape ) is one of the most economical fruit trees in the world . It is one of the most important factors to prevent and cure virus diseases . The regeneration medium contains 1 / 2 MS + 0.5 mg L - 1 BA + 7 g L - 1 agar . The regenerated medium contains 1 / 2 MS + 0.5 mg L - 1 BA + 7 g L - 1 agar . The regeneration medium contains 1 / 2 MS + 0.5 mg L - 1 BA + 7 g L - 1 agar . The regeneration medium contains 1 / 2 MS + 0.5 mg L - 1 BA + 7 g L - 1 agar . The highest regeneration rate is ' Red Xia Zhu ' ( 71.7 % ) , and the lowest is ' White River 35 - 1 ' ( V . pseudoreticulata ' Baihe 35 - 1 ' , 21.7 % ) . The results showed that there were no abnormal bands in the shoot tip . After 2 weeks , the stem tip was transferred to the regeneration medium for 30 min . The stem tip was then transferred to the regeneration medium for 24 h . The results showed that GLRa V - 3 was used to remove GLRaV - 3 from the stem segments ( about 3 cm in length and 2 - 3 leaves ) .

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S663.1

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