荷斯坦奶牛免疫球蛋白重链基因位点结构及其多样性形成机制的研究

发布时间：2018-01-12 03:00

  本文关键词：荷斯坦奶牛免疫球蛋白重链基因位点结构及其多样性形成机制的研究　出处：《中国农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)是适应性免疫最重要的效应分子之一,其中跨膜型IgM又是B淋巴细胞发育的关键受体分子。在人和小鼠中,IgM编码基因的突变会导致B细胞的缺失,从而引起严重的免疫缺陷。以前的研究发现牛免疫球蛋白重链基因有着非常独特的特点——基因组中存在着两个有功能的免疫球蛋白重链基因位点,分别位于21号和11号染色体上,它们各有一个编码IgM的μ基因。免疫球蛋白基因表达过程中存在等位排斥现象,即一条染色体上免疫球蛋白基因的成功表达会使对应的同源染色体上的基因片段的重组关闭,因此牛两个位点上的μ基因如何协调表达以保证B细胞的正常发育和每个B细胞的单一抗原特异性是一个令人困扰的问题。此外,与人和小鼠相比,牛免疫球蛋白重链可变区基因片段数目非常有限,它如何利用很少的可变区基因片段产生足够多的抗体多样性是另外一个值得探讨的重要问题。本研究通过尼龙膜原位杂交方法对荷斯坦奶牛RP42-BAC文库进行了全面的筛选并获得了30个包含牛重链基因的BAC克隆。利用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)实验确定牛基因组中只存在一个免疫球蛋白重链基因位点并位于21号染色体上,而在11号染色体上不存在有功能的重链基因位点。基于对7个BAC克隆的全长测序和长片段PCR实验,我们获得了包括部分V区在内的免疫球蛋白重链基因位点结构信息,所测得的基因组片段按如下顺序排列：5'-VHn-DHn-JHn-μ1-(ψδ-ψV-DHn)3-JHn-μ2-δ-γ3-γ1-γ2-δ-α-3'。本研究发现两个有功能的μ基因线性排列在同一重链基因位点上,因此并不存在等位排斥问题。这两个μ基因除了可以通过VDJ重组独立表达外,μ2基因也可以通过CSR机制(class swit ch recombination, CSR)进行表达。表达分析显示荷斯坦奶牛在整个发育阶段的几乎各个器官组织中都主要表达IgM2(μ2)亚型。分析IgM1和IgM2的重链可变区序列发现二者在阳性/阴性选择以及物理化学性质上并无显著差异。在长约284 Kb的部分V区序列中仅发现了12个有功能的VH基因片段,它们属于同一家族而且具有很高的同源性(89%)。在四个DH位点中共发现23个DH片段,16个具有重组功能,其中有一个超长的DH片段,其编码长度达到149 bp。VDJ重组分析证明IgMl和IgM2对于DH,JH片段的使用都有着极强的偏好性,这导致VH-DH-JH的组合多样性更加有限。通过与人和小鼠可变区CDR3H cDNA序列的比较,发现牛CDR3H的长度变化范围非常广(3-60+aa),而N,P核苷酸加入情况与小鼠类似,推测牛免疫球蛋白显著的连接多样性的产生更依赖由外切酶的剪切作用导致的CDR3H长度和序列变化的多态性。cDNA序列分析发现有功能的超长CDR3H只存在于IgM2亚型,且全部由DH8片段参与编码,但分析基因组中VDJ重组产物发现通过超长N,P核苷酸的加入,部分其他DH片段也可以参与超长CDR3H的产生。另外由于参与编码牛IgM2 CDR3H的DH片段长度普遍较长,IgM2CDR3H的平均长度也明显长于人,小鼠以及牛IgM1。牛主要依赖半胱氨酸形成的二硫键稳定CDR3H的空间结构和产生空间多样性,这在超长CDR3H中体现得更加明显。综上所述,我们证明牛基因组中只有一个免疫球蛋白重链基因位点,并获得了较为完整的结构信息。虽然牛的两个μ基因都具有功能,但在各个组织和不同发育时期主要表达μ2基因。牛主要通过增加连接多样性程度和CDR3H平均长度来弥补因为可变区基因片段数目有限造成的VDJ重组多样性的不足。此外,牛超长CDR3H主要是通过DH8基因片段参与重组产生,理论上也可以通过超长N,P核苷酸的插入形成。本研究为理解牛免疫球蛋白重链基因的多样性产生机制以及牛两个μ基因的协同表达的问题提供了明确的线索和证据。
[Abstract]:In this study , we found that there are two functional immunoglobulin heavy chain gene loci on chromosome 21 and chromosome 11 . In conclusion , we prove that there is only one immunoglobulin heavy chain gene locus in the bovine genome , and the more complete structural information is obtained . Although the two 渭 genes of the cattle have the function , we can compensate for the deficiency of VDJ recombination diversity due to the limited number of genes in the variable region . In addition , the bovine extra - long CDR3H is mainly formed by the insertion of the DH8 gene fragment . In addition , the bovine extra - long CDR3H is mainly formed by the insertion of the DH8 gene fragment .

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
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本文编号：1412363