E.tenella宿主细胞钙稳态在线粒体凋亡途径中的作用与机理

发布时间：2018-01-13 02:01

  本文关键词：E.tenella宿主细胞钙稳态在线粒体凋亡途径中的作用与机理　出处：《山西农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：为了探讨E.tenella宿主细胞钙稳态在线粒体凋亡途径中的作用与机理,采用原代鸡胚盲肠上皮细胞培养技术、酶联免疫分析技术、分光光度计技术、HE染色技术、流式细胞技术和荧光定量PCR技术等,对细胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM).胞外钙离子螯合剂(EGTA)、内质网上三磷酸肌醇受体(IP_3R)和兰诺定受体(RyR)通道阻断剂(肝素钠和Ryanodine)、钙蛋白酶抑制剂(SJA6017)和钙调蛋白抑制剂(三氟拉嗪)处理和非处理的E.tenella宿主细胞凋亡率、虫体感染率、线粒体通透性转运孔(MPTP)开放情况、钙离子浓度、胞浆内细胞色素C (Cytc)含量、Ca~(2+)-ATP酶活性、细胞内钙蛋白酶含量、细胞内Bax和Bid mRNA及蛋白表达量、细胞内钙调神经磷酸酶含量及细胞内Bad和14-3-3蛋白表达量的动态变化进行了测定,结果表明：(1)接种E.tenella子孢子后4-120h,子孢子接种不加药组(TO)宿主细胞内的钙离子荧光强度极显著(P0.01)或显著(P0.05)高于空白对照组(C),表明E.tenella感染宿主细胞会引起宿主细胞内钙离子浓度升高。(2)接种E.tenella子孢子后,除4h和120h,胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM)组(T3组)的宿主细胞内游离钙离子浓度极显著(P0.01)或显著(P0.05)低于TO组；在接种后4h,T3组宿主细胞凋亡率显著(P0.05)高于TO组,而在接种后24-120h,T3组宿主细胞早期凋亡率在48h、96h和120h显著(P0.05)或极显著(P0.01)低于T0组,T3组宿主细胞晚期凋亡率和坏死率极显著(P0.01)低于TO组；在接种子孢子后4-120h,T3组宿主细胞内Calcein-AM~+的平均荧光强度都高于TO组,而在96h和120h,T3组细胞内Calcein-AM~+的平均荧光强度显著(P0.01或P0.05)高于TO组；接种子孢子后4h,T3组细胞胞浆内Cytc的含量显著高于T0组(P0.05),而接种子孢子后24-120h,T3组细胞胞浆内Cytc的含量低于TO组,其中24h、96h和120h细胞胞浆内Cytc的含量显著(P0.01或P0.05)低于TO组。由此可得出, E.tenella宿主细胞内游离钙离子浓度变化可以调节MPTP开放程度和胞浆内Cytc的含量,从而调控宿主细胞的凋亡。(3)接种E.tenella子孢子后4-120h,胞外钙离子螯合剂(EGTA)组(T2组)和内质网上的IP_3R和RyR钙离子通道阻断剂(肝素钠和Ryanodine)子孢子接种组(T1组)细胞内Ca~(2+)的平均荧光强度都低于TO组,在48h、96h、120h,T2组细胞内Ca~(2+)的平均荧光强度极显著(P0.01)或显著(P0.05)低于TO组；在48-96h,T1组细胞内Ca~(2+)的平均荧光强度极显著(P0.01)低于T0组。表明,细胞外钙离子浓度的变化和内质网上的钙离子通道对E.tenella宿主细胞内游离Ca~(2+)浓度起着非常重要的调控作用。(4)接种E.tenella子孢子后4h,T1和T2组宿主细胞凋亡率、胞浆内Cytc都高于TO组,而接种后24-120h,T1和T2组宿主细胞凋亡率、胞浆内Cytc都低于TO组；接种子孢子后4-120h,T1和T2组宿主细胞内Calcein-AM~+的平均荧光强度都高于TO组；在接种子孢子后4h,T1和T2组Ca~(2+)-ATP酶活性低于TO组,而在接种子孢子后24-120h,T2组Ca~(2+)-ATP酶活性高于TO组。表明降低胞外游离钙离子浓度和阻断内质网上的钙离子通道可以使E.tenella宿主细胞降低MPTP开放和Cytc释放,提高Ca~(2+)-ATP酶活性。(5)接种E.tenella子孢子后4h,子孢子接种不加药组(TO组)宿主细胞内钙蛋白酶含量极显著(P0.01)低于C组,而在接种后24-120h,TO组细胞内钙蛋白酶的含量都极显著(P0.01)高于C组；在接种4h后,细胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM)组(T3组)宿主细胞内钙蛋白酶的含量极显著高于(P0.01)TO组,在接种后24h、72h、96h和120h T3组宿主细胞内钙蛋白酶的含量极显著(P0.01)或显著(P0.05)低于TO组。表明,E.tenella感染早期会引起宿主细胞内钙蛋白酶含量降低,而中后期升高,并且降低细胞内Ca~(2+)浓度会导致钙蛋白酶的含量减少。(6)接种E.tenella子孢子后4h、48h、96h和120h,钙蛋白酶抑制剂(SJA6017)组(T4组)宿主细胞内Calcein-AM~+的平均荧光强度显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于TO组；在接种后4h,T4组宿主细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率和坏死率都高于TO组,其中晚期凋亡率和坏死率极显著(P0.01)高于TO组,在接种后24-120h,T4组宿主细胞的早期凋亡率低于TO组,其中在48h、96h和120h T4组宿主细胞的早期凋亡率显著(P0.01或P0.05)低于T0组,在接种后24-120h,T4组宿主细胞的晚期凋亡率和坏死率极显著(P0.01)或显著(P0.05)低于T0组,表明细胞内钙蛋白酶可以通过调节MPTP的通透性调控E.tenella诱导的宿主细胞凋亡。(7)接种E.tenella子孢子后4h,TO组宿主细胞内Bax、Bid mRNA和蛋白表达量均显著(P0.01或P0.05)低于C组,T4组Bax、Bid mRNA和蛋白表达量均高于TO组,其中T4组Bax mRNA表达量显著(P0.05)高于T0组；而接种24-120h,TO组宿主细胞内Bax、Bid mRNA和蛋白表达量均显著(P0.05)高于C组,除120h时外,Bax含量均显著(P0.01或P0.05)高于C组,T4组Bax、Bid mRNA和蛋白表达量低于TO组,其中T4组Bax mRNA表达量在24-72h极显著(P0.01)低于T0组,Bid mRNA表达量在24h-120显著(P0.01或P0.05)低于TO组,Bax蛋白表达量在48h显著(P0.05)低于TO组,Bid蛋白含量在48h、72h和120h显著(P0.01或P0.05)低于TO组。表明感染E.tenella的宿主细胞Bax、Bid基因表达上调,钙蛋白酶可以通过调节Bax、Bid的表达调控E.tenella诱导的宿主细胞线粒体凋亡通路。(8)接种E.tenella子孢子后4h,子孢子接种不加药组(TO)宿主细胞内钙调神经磷酸酶含量低于C组(P0.05),而在接种后24-120h,除96h外,其余时间TO组细胞内钙调神经磷酸酶的含量都极显著(P0.01)或显著(P0.05)高于C组；在接种后4h,细胞内钙离子螯合剂(BAPTA/AM)组(T3组)细胞内钙调神经磷酸酶的含量高于TO组(P0.05),而在接种子孢子后24h、48h和120h,T3组细胞内钙调神经磷酸酶的含量极显著(P0.01)或显著(P0.05)低于T0组。表明E.tenella感染宿主细胞早期会引起宿主细胞内钙调神经磷酸酶含量降低,而中后期升高,并且钙调神经磷酸酶的变化受到细胞内Ca~(2+)的调节。(9)在接种E.tenella子孢子后4h-120h,钙调蛋白抑制剂(三氟拉嗪)组(T5组)细胞内的Calcein-AM~+的平均荧光强度都高于TO组,其中120h T5组细胞内的Calcein-AM~+的平均荧光强度显著(P0.05)高于T0组；在接种后4h,T5组细胞的早期凋亡率及晚期凋亡率和坏死率极显著(P0.01)或显著(P0.05)高于TO组,而在接种子孢子后24-120h,T5组细胞的早期凋亡率均极显著(P0.01)或显著(P0.05)低于TO组,T5组宿主细胞晚期凋亡和坏死率在接种后48h-120h极显著(P0.01)低于TO组,表明钙调蛋白通过调节钙调神经磷酸酶和MPTP的通透性调控E.tenella的宿主细胞凋亡。(10)接种E.tenella子孢子后4h,TO组宿主细胞内Bad、14-3-3蛋白含量显著(P0.05)低于C组,T5组Bad、14-3-3蛋白含量高于TO组(P0.05)；而接种子孢子后24-120h,TO宿主细胞内组Bad、14-3-3蛋白含量高于C组,其中48-120h,Bad的含量显著(P0.05)高于C组,在24h、72h、96h和120h,14-3-3蛋白的含量显著(P0.05)高于C组,T5组宿主细胞内Bad、14-3-3蛋白含量低于TO组,其中在72h,Bad蛋白含量显著(P0.05)低于TO组。表明E.tenella宿主细胞Bad、14-3-3蛋白表达上调,钙调蛋白可以通过调节Bad、14-3-3的蛋白表达调控E.tenella宿主细胞线粒体凋亡通路。
[Abstract]:The dynamic changes of calcium ion chelating agent ( BAPTA / AM ) , intracellular calcium ion chelating agent ( EGTA ) , calcium ion concentration , intracellular calcium ion chelating agent ( EGTA ) , Ca ~ ( 2 + ) - ATPase activity , intracellular calcium protease content , intracellular Bax and Bid mRNA and protein expression , intracellular calcineurin , intracellular Bad and 14 - 3 - 3 protein expression were measured . The results showed that : ( 1 ) Ca ~ ( 2 + ) - ATPase activity , intracellular calcium protease content , intracellular Bax and Bid mRNA and protein expression were significantly higher than that in the blank control group ( C ) , suggesting that E . tenella infected host cells could cause an increase in calcium ion concentration in host cells . (2)鎺ョ�岴.tenella瀛愬�㈠瓙鍚�,闄，

本文编号：1416942