锌营养对肉鸡肠黏膜及Caco-2细胞肠上皮屏障功能的作用及机制

发布时间：2018-01-13 22:17

本文关键词：锌营养对肉鸡肠黏膜及Caco-2细胞肠上皮屏障功能的作用及机制　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：本研究主要通过4个试验来研究锌对肠道黏膜屏障的影响及其机理。试验一研究早期锌营养对肉鸡肠黏膜屏障功能的影响。试验选用1日龄健康雄性AA+雏鸡600只,按照2×3因子随机试验设计,分成6个处理,每个处理10个重复,研究添加不同时期的硫酸锌分别为无锌、全期添加锌(35d添加),限期添加锌(前14d添加硫酸锌+后21d无锌),鼠伤寒沙门氏菌(感染或不感染)以及他们的互作效应,其中锌含量均为120mg/kg。试验期限为35d。沙门氏菌感染显著降低0-21d(P0.05)平均体增重及平均料重比;提高了(P0.05)21d脾脏指数以及35d法氏囊及脾脏指数;提高了(P0.05)21d血清内毒素、FITC及回肠粘膜乳酸脱氢酶含量、促炎症因子IL-1β及TNF-α的mRNA表达量;有提高TLR-4(P=0.073)的趋势;降低了(P=0.024)紧密连接蛋白ZO-1的表达。与无锌相比,添加全期及限期硫酸锌均能显著提高0-21d(P=0.011)平均体增重,限期添加锌降低了 0-21d料重比(P=0.02),提高了(P0.05)1L-1β、IL-10及ILR-4的mRNA表达;全期添加锌显著降低了 21d血清内毒素含量(P0.001),提高了(P0.05)IL-10及GPR39的mRNA表达量;全期及限期硫酸锌的添加均能显著提高(P=0.035)21d回肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1的mRNA表达。结果表明,肉鸡早期日粮中添加硫酸锌可促进其后期生产性能的提高、免疫机能的激活以及紧密连接蛋白的表达,与全期添加硫酸锌无明显区别,可替代全期添加硫酸锌。试验二研究锌通过G蛋白偶联受体(GPR39)调节沙门氏菌感染Caco-2细胞屏障功能的机制。锌已被证实能够减缓鼠伤寒沙门氏菌对肠道屏障功能的损伤,但具体的细胞内外相关机制还不清楚。本试验通过在transwell的培养皿内培养Caco-2细胞,构建单层细胞肠上皮模型,采用小干扰RNA的方法预先沉默GPR39以及PKCζ基因,进而添加不同浓度的锌进行预处理,最后感染鼠伤寒沙门氏菌,检测肠上皮细胞的电阻值、通透性、紧密连接蛋白及信号分子GPR39、PKCζ的表达,进而探索信号分子GPR39及PKCζ在锌调控肠道屏障功能中的作用。结果发现,沙门氏菌感染显著抑制了上皮细胞电阻值及紧密连接蛋白ZO-1及occludin的表达(P0.05),显著提高了上皮通透性(P0.05),并降低了TLR 及PXCζ的mRNA表达及PKCζ的蛋白表达水平(P0.05)。50、100 μM的锌显著增加了电阻值,降低了肠道通透性及沙门氏菌的入侵数量。100 μM锌促进了紧密连接蛋白ZO-1及occludin的表达,并上调了 GPR39及PKCζ的表达。沉默GPR39基因时,PKCζ的表达也同时受到抑制,抑制了锌对肠道完整性的改善作用,主要表现为降低了感染沙门氏菌后细胞内ZO-1及E-cadherin蛋白的表达。沉默PKCζ基因时,抑制了锌对ZO-1及E-cadherin蛋白表达的促进作用,但对GPR39的mRNA表达无显著影响。因此,我们第一次证实了锌通过GPR39激活了 PKCζ参与的紧密连接分子ZO-1及E-cadherin的表达,进而改善了沙门氏菌对肠道屏障功能的损伤。试验三研究锌通过PI3K/AKT/mTOR信号通路增强了 Caco-2细胞的肠道屏障功能。锌具有维持肠道屏障功能及调节细胞信号识别和蛋白激酶的活性等重要功能。磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)级联信号具有调节细胞间完整性及紧密连接蛋白的作用。本试验主要是探索锌是否能够通过PI3K/AKT/mTOR信号通路改善肠上皮紧密连接的完整性。Caco-2单层上皮细胞模型用0,50,100 μM锌的DMEM作用特定时间点后,检测上皮电阻、旁细胞通透性、细胞增值、分化、凋亡及自噬。与对照组相比,50,100 μM锌作用6,12,24h均能促进细胞生长,并促进了 24h时细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。100μM锌显著提高了 6-24h的电阻值,减少了24h的通透性,上调了碱性磷酸酶活性以及ZO-1的表达。此外,100 μM锌激活了 P-AKT及P-mTOR的表达。而PI3K抑制剂抵消了锌对碱性磷酸酶、电阻值、ZO-1、P-AKT及P-mTOR的诱导和激活。此外,PI3K抑制剂促进了上皮细胞通透性增加,提高了凋亡蛋白caspase-3及自噬蛋白LC3Ⅱ的表达量。总之,锌通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进了细胞分化以及紧密连接蛋白ZO-1的表达,进而改善了肠道屏障功能。试验四研究日粮中添加不同来源的锌对肉鸡肠黏膜屏障功能的调节机制。试验选用1日龄健康雄性AA+雏鸡600只,按照2×3因子随机试验设计,分成6个处理,每个处理10个重复,研究添加不同来源的锌分别为无锌(0)、硫酸锌(ZnSO4),蛋氨酸羟基类似物螯合锌(MHA-Zn),鼠伤寒沙门氏菌(感染或不感染)以及他们的互作效应,其中锌含量均为120mg/kg。试验为21天。沙门氏菌感染显著降低肉鸡(P0.05)平均体增重及21日龄平均采食量,提高了 14日龄平均料重比(P0.001);对血液白细胞有增加的趋势(P=0.059),提高了(P0.001)中性粒细胞以及单核细胞数量;降低了空肠绒毛高度与隐窝深度之比(P0.001);提高了(P0.05)血清D木糖含量、14日龄血清FITC及21日龄血清内毒素含量;提高了(P0.05)14日龄回肠黏膜TNF-α、IL-8、IL-1β及紧密连接蛋白claudin-1RNA表达;降低了 21日龄ZO-1的mRNA(P=0.002)表达。日粮中添加无机锌及有机锌均能显著提高肉鸡(P0.05)平均体增重及21日龄平均耗料量。无机及有机锌均能降低14日龄血清中D木糖含量(P=0.001)。硫酸锌降低了(P0.05)21日龄血清FITC含量及14日龄claudin-1 mRNA的表达,有降低14日龄血清内毒素含量的趋势(P=0.064);提高了 21日龄ZO-1(P=0.009)及信号分子GPR39(P=0.046)的mRNA表达。有机锌显著降低了(P=0.006)21日龄回肠黏膜TNF-α的mRNA表达,提高了(P0.05)IL-1β、IL-10及TLR-4的mRNA表达。此外,感染沙门氏菌与锌对中性粒细胞及单核细胞数量、空肠绒毛高度、21日龄回肠黏膜IL-1β及IL-10的mRNA表达量有显著互作效应,即在感染沙门氏菌条件下,无机锌与有机锌均能显著降低(P0.05)血液中性粒细胞及单核细胞数量,降低空肠绒毛高度(P=0.003);有机锌显著提高了IL-1β及IL-10的mRNA水平。结果表明,有机锌及无机锌均能够有效改善感染沙门氏菌肉鸡生产性能及肠道形态结构,无机硫酸锌可改善肠道屏障的完整性,表现为降低肠道通透性,提高紧密连接的表达。有机锌可激活机体免疫机能,对肠道完整性无改善作用。综上所述,肉鸡早期日粮中添加硫酸锌可促进其后期生产性能的提高、免疫机能的激活以及紧密连接蛋白的表达,可替代全期添加硫酸锌。体外试验表明硫酸锌改善了沙门氏菌对肠上皮屏障功能的机制是通过GPR39激活了 PKCζ参与的紧密连接分子ZO-1及E-cadherin的表达。此外,硫酸锌还可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进了细胞分化以及紧密连接蛋白ZO-1的表达。通过对比无机硫酸锌,有机蛋氨酸羟基类似物螯合锌也可有效改善肉鸡生产性能并激活机体及肠黏膜的免疫机能,对肉鸡肠黏膜屏障功能无明显改善作用。
[Abstract]:The effects of zinc on intestinal mucosal barrier function were studied by means of four experiments . The effect of early zinc nutrition on intestinal mucosal barrier function was studied . The expression of ZO - 1 and E - cadherin in intestinal barrier was studied . The expression of IL - 1尾 , IL - 10 and IL - 10 in serum of 21 - day - old were significantly decreased ( P = 0.064 ) . The results showed that zinc sulfate could improve the expression of IL - 1尾 and IL - 10 in serum of 14 - day - old .

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S831.5

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