柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母基因组学分析及青绿霉病原菌特异性检测与防治

发布时间：2018-01-15 00:24

本文关键词：柑橘采后生防菌柠檬形克勒克酵母基因组学分析及青绿霉病原菌特异性检测与防治　出处：《华中农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：柑橘是世界第一大水果,然而在采后贮运时,柑橘果实会遭受巨大的腐烂情况,引起严重的经济损失,防治腐烂自然而然就成为全世界高度关注的研究重点。采用化学防治的方法一直以来是园艺领域相当普遍的防治手段,鉴于化学药剂的一些缺陷与当今绿色农业、环境保护、食品安全等主题的冲突,生物防治逐渐为全球重视。其中,生防酵母成为真菌病害防治的主力军之一。本研究基于高通量测序,对柑橘生防菌柠檬形克勒克酵母(34-9)(Kloeckera apiculata)进行全基因组测序,研究其遗传物质的基本特征、进化层面的基因特有和共有特征,以及它在整个酵母菌领域的谱系特有基因特征。另从病原菌的角度开发特异性的分子标记对柑橘青绿霉病原菌意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(Penicillium digitatum)进行快速检测。同时从生防细菌角度出发,筛选到青绿霉拮抗细菌解淀粉芽孢杆菌DH-4(Bacillus amyloliquefaciens),并较为深入的研究了其抑菌机理。主要结果如下:1.酵母34-9全基因组测序。本测序在Illumina Hi Seq 2000平台执行,采用双端测序paired-end(PE)和mate-paired(MP)的方法构建了四个插入文库,分别为170 bp、500 bp、800bp和3 Kb。总DNA被组装为106个contig序列,最终被进一步组装为41个scaffold序列,基因组约8.1 Mb,GC含量为32%,测序覆盖度234倍。经预测,34-9中含3786个基因,可编码3786个蛋白。其中2724个蛋白序列能与KOG数据库匹配并得到功能分类。Uni Prot数据库注释结果显示,1127个基因得到GO分类注释。基因组中预测到3个r RNA、3个micro RNA、71个t RNA、1066个微卫星位点,重复序列占据0.37%。在代谢途径预测中发现与苯丙氨酸代谢相关的基因。基因匹配和结构分析发现柠檬形克勒克酵母独特之处,并与克鲁维酵母属有较多同源基因。比较基因组分析发现34-9与葡萄汁有孢汉逊酵母极高的线性区域,SSR分析发现34-9的6种重复类型中单核苷酸和三核苷酸重复单元居多。2.酵母34-9共有、特有基因。本分析基于比较基因组和同源比对法对有孢汉逊酵母属内已测序的三种酵母K.apiculata、Hanseniaspora uravum、H.vineae做共有和特有基因分析。首先运用Augustus软件从H.vineae中预测到4746个蛋白序列以供同源比对。采用Treefam的方法对三个酵母的全部蛋白进行all-against-all BLASTp比对,最后得到3223个基因家族,包含1400个单拷贝基因、310个多拷贝基因家族,三者共有基因分别为2108个、2056个、2242个,特有基因数目分别为275个、129个、1695个。基因组水平的系统发生分析看出K.apiculata与H.uravum亲缘关系最近。并且三者的共有、特有基因家族获得功能分类,两两之间线性匹配的区域得到明晰。3.酵母34-9谱系特有基因。本研究立足生物信息学和同源比对,共收集了80个已基因组测序的酵母种,涵盖了32个酵母属的80个不同种。其中51株酵母的蛋白质序列已公布,亦作为参考对象。3786个K.apiculata蛋白序列经BLASTp、TBLASTN、PSIBLAST多次同源比对,揭示了两套有孢汉逊酵母属的谱系特有基因(LSGs):柠檬形克勒克酵母独有基因,即孤儿基因(orphan genes)共109个,344个有孢汉逊酵母属特有基因(HSGs),其他3333个基因为进化保守基因(ECs)。基因特点分析揭示了LSGs一定的独特性:LSGs的外显子均长明显短于ECs,其基因长度亦短于ECs,GC含量相近,两套LSGs分布在基因组的34个scaffold序列上,其分布数量与scaffold长度呈显著共相关。Prot Fun揭示LSGs的细胞功能主要集中于翻译、氨基酸合成、细胞被膜、能量代谢等。75%的孤儿基因和57%的HSGs存在GO分类,以生长因子、转录和转录调控最为丰富。该功能推断显示部分LSGs可能有基因扩张的趋势,LSGs在某些特殊物种中有成为重要管家基因的潜力。新基因起源的分析中发现有6个LSGs有旁系同源基因(paralog),其中四个基因具进化保守性,可能来源于基因复制。总体来说,基因复制不占主导作用。q RT-PCR表明部分LSGs表达响应非生物胁迫,基因34-9_2335和34-9_3527可能与耐寒有关,34-9_280、34-9_882、34-9_1238、34-9_1749、34-9_2335、34-9_3527明显响应热胁迫,34-9_108、34-9_1238可能与调节酸碱有关,34-9_225、34-9_1511、34-9_3527、34-9_3687明显响应碱性环境。4.青绿霉特异性分子标记。在鉴定柑橘病原菌时偶尔会遭遇高度同源而无法分辨种类的情况。本部分基于真菌保守基因和青霉属基因组,将指状青霉、意大利青霉、产黄青霉、扩展青霉的保守基因RPB1、RPB2、cmd、β-tubulin和COI的同源区域的碱基突变位点作为引物上下游序列,开发出能特异性检测指状青霉和意大利青霉的引物。特异引物RPB1-1和cmd-3可快速特异地检测出指状青霉,38株对象菌株中共有14株最终被鉴定为指状青霉。另外,引物RPB1-a和RPB1-b可快速特异检测意大利青霉,共从39株对象菌株中检测到6株菌为意大利青霉。所开发特异引物均具高度准确性和特异性。5.菌株DH-4对青绿霉的抑菌机理。为寻求更多的方法抑制柑橘青绿霉,本部分筛选出高效的拮抗细菌DH-4,经16S r DNA方法鉴定为解淀粉芽孢杆菌。该菌表现出广谱抗真菌性,尤其对青霉属真菌以及其它园艺产品真菌病害。其发酵滤液在柑橘活体上表现出良好的绿霉病抑制性,滤液极其稳定,在高温、光照、挥发、不同p H值作用下仍然表现出明显的抑菌性。运用超高效液质联用(UPLC/ESI-MS)等方法,滤液中抗菌活性物质被分为五类:大环内酯类(Macrolactin)、多烯类(Bacillaene)、伊枯草菌素(Iturins)、表面活性素(Surfactin)和丰原素(Fengycin)。通过透射电镜观察发现解淀粉芽孢杆菌可能的抑菌模式为:分泌抗菌活性物质到体外,进入指状青霉细胞质,逐步破坏线粒体和液泡结构,使其空泡化、渗漏、紊乱等,从而抑制甚至杀死菌体。扫描电镜观察了明显病斑以前的过程,滤液对孢子萌发和菌丝生长有明显抑制作用。综上研究结果,生防菌34-9和DH-4是从酵母和细菌的两个角度来为柑橘采后真菌病害的防治提供理论、数据支撑和潜在的应用价值。开发青绿霉病原菌特异性分子标记亦可快捷高效地应用于柑橘采后病原菌的检测。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.66;S476

【参考文献】