新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究

发布时间：2018-01-18 12:02

本文关键词：新疆非禽类野生动物流感抗体调查与流感病毒样颗粒疫苗研究　出处：《石河子大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：A型流感病毒是真正人畜共患病原并具有高度传染性。尽管A型流感病毒有着严格的宿主范围,但是跨种传播时有发生。近年来除了人可被禽流感H5N1、H9N2和H7N9病毒感染外,还有多种动物被流感病毒感染的报道,并从猫、果子狸、老虎、狮子和红狐中分离到H5N1禽流感病毒。野生鸟类被看作是A流感病毒的主要携带者,随着其长距离跨境迁徙潜在传播并扩散病毒。新疆位于候鸟东非-西亚迁徙线,境内栖息着大量鸟类和非禽类野生动物。由于野生动物和这些迁徙的鸟类共享栖息地,野生动物存在被流感病毒感染的风险。鉴于动物流感的严重危害性及野生动物携带流感病毒的潜在威胁性,本研究中利用血凝抑制试验(HI)和竞争ELISA(c-ELISA)方法调查了新疆非禽类野生动物中流感H5、H7和H9亚型的暴露现状,为野生动物流感防控提供数据资料。A型流感病毒通过突变、重配和重组不断地适应着新宿主,疫苗是预防其暴发流行的有效手段。病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)可通过其结构蛋白自我组装出芽形成病毒粒子,结构模拟病毒自身但是不能自我复制,确保了安全性及免疫原性。同时,因流感VLPs不依赖于鸡胚而被视为流感疫苗候选者。目的:本研究以流感病毒为研究对象,调查新疆部分非禽类野生动物中禽流感血清学数据,并利用家蚕及Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建流感VLPs研究其免疫原性,为流感储备疫苗研究提供数据参考。(1)了解新疆非禽类野生动物禽流感暴露现状;(2)探索以家蚕作为生物反应器生产流感VLPs;(3)探索Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备流感新型储备疫苗;(4)评估流感嵌合病毒样颗粒(cVLPs)免疫原性。方法:(1)采用HI及c-ELISA方法对2009年~2013年采集的246份野生动物(盘羊、岩羊、鹅喉羚、牦牛、野猪、马鹿、狼、北山羊及狍子)血清样品进行禽流感病毒H5、H7及H9亚型的血清学调查。(2)构建家蚕重组杆状病毒rBmNPV(HA-M1-NA),感染家蚕5龄幼虫及蚕蛹,经血凝抑制试验、电镜观察、小鼠免疫试验及攻毒保护评价家蚕杆状病毒表达流感VLPs免疫原性。(3)利用Bac-to-Bac表达系统构建重组杆状病毒AcMNPV(HA-M1-NA),感染昆虫细胞Sf 9,经western blotting及免疫荧光检测目的蛋白表达、电镜观察流感VLPs、小鼠免疫后检测T细胞增殖及测定细胞因子浓度,评价Bac-to-Bac表达系统构建重组流感VLPs免疫原性。(4)将纤毛蛋白基因fliC通过基因合成嵌合于流感病毒HA基因中构建流感cVLPs,经western blotting及免疫荧光检测目的蛋白表达、电镜观察流感病毒样颗粒、小鼠免疫后检测IgG水平和测定细胞因子浓度及攻毒试验,评价流感病cVLPs免疫原性。结果:(1)新疆部分非禽类野生动物禽流感血清学调查:HI检测结果显示4.47%血清样品流感抗体阳性;狼和盘羊血清样品H7亚型抗体阳性率分别为9.09%和4.55%;鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清样品H9亚型抗体阳性率分别为2.27%,27.27%,23.08%和4.55%。c-ELISA结果显示4.88%血清样品流感抗体阳性;鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清阳性率分别为6.82%,36.36%,23.08%和9.09%。马鹿、野猪、北山羊、狍子和牦牛血清样品中禽流感H5、H7及H9亚型抗体均为阴性。(2)家蚕及蚕蛹能正确表达并组装具有血凝活性的流感病VLPs,获得的流感VLPs免疫小鼠之后,可诱导小鼠产生特异性抗体;攻毒保护试验结果表明获得的流感颗粒具有较强的免疫原性;肌注免疫途径效果最佳。(3)利用Bac-to-Bac表达系统成功构建重组杆状病毒AcMNPV(HA-M1-NA),感染昆虫细胞Sf 9之后,细胞能够正确表达流感病VLPs,该VLPs免疫小鼠能诱导T细胞活化,血清中可检测到高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子,表明Bac-to-Bac/IC系统表达的流感VLPs可诱导Th1和Th2型免疫反应。(4)重组杆状病毒AcMNPV-HA-fliC-NA-M1,感染昆虫细胞Sf 9之后,细胞能够表达并正确组装流感cVLPs,该cVLPs免疫小鼠可诱导T细胞活化;血清中可检测到高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子;cVLP免疫小鼠血清中有较高水平IgG抗体,且IgG抗体亚型分布以IgG1和IgG2b为主;攻毒保护试验结果表明获得的流感cVLPs具有异源异型交叉保护性。结论:(1)一定比例新疆非禽类野生动物曾感染过禽流感病毒。鹅喉羚、狼、岩羊和盘羊血清样品H9亚型抗体阳性;狼和盘羊血清样品H7亚型抗体阳性;马鹿、野猪、北山羊、狍子和牦牛血清样品H5、H7及H9亚型抗体均为阴性。(2)家蚕杆状病毒表达系统能够表达并组装有血凝活性的流感VLPs;该VLPs免疫小鼠后可诱导产生特异性抗体;攻毒保护试验表明其具有较强的免疫原性;肌注免疫途径效果最佳。(3)Bac-to-Bac杆状病毒表达系统能表达并正确组装出具有较强免疫原性的流感VLPs,该VLPs可诱导免疫小鼠机体产生Th1和Th2型免疫反应。(4)成功制备流感cVLPs且具有较强的免疫原性,可诱导小鼠T细胞活化,血清中有高浓度的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ细胞因子及IgG抗体。攻毒保护试验结果表明cVLPs具有异源交叉保护性。
[Abstract]:In this study , we investigated the status of influenza H5 , H7 and H9 subtype in non - avian wild animals in Xinjiang . The recombinant baculovirus AcMNPV ( HA - M1 - NA ) was constructed by the recombinant baculovirus AcMNPV ( HA - M1 - NA ) . The results showed that the positive rates of influenza virus - like particles were 2.27 % , 27.27 % , 23.08 % and 4.55 % respectively . Conclusion : ( 2 ) The recombinant baculovirus AcMNPV - HA - fliC - NA - M1 can induce the activation of T cells . The recombinant baculovirus AcMNPV - HA - fliC - NA - M1 can induce the activation of T cells . ( 3 ) The expression system can express and correctly assemble influenza VLPs with stronger immunogenicity , which can induce Th1 and Th2 immune responses in immune mouse body . ( 4 ) The preparation of influenza - cVLPs can induce the activation of T cells in mice , and the serum has high levels of IL - 2 , IL - 4 , IL - 10 and IFN - 纬 cytokines and IgG antibodies .

【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.9

【相似文献】