H9N2和H10N7亚型禽流感病毒对小鼠神经嗜性和致病性的机制研究

发布时间：2018-01-19 19:04

本文关键词： H9N2亚型AIV H10N7亚型AIV 鼠适应毒神经嗜性致病性　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：禽流感病毒(AIV)跨种间屏障感染人与哺乳动物是流感病毒研究领域重要的研究课题。临床调查与研究表明,AIV不仅可以感染人的呼吸系统,也可以感染人的中枢神经系统(CNS),造成不同的神经病理反应而表现出神经嗜性和高致病性。然而,多年来,人们主要关注的是病毒对呼吸系统感染与致病机制的研究,而对神经系统的感染与致病机制关注较少。因此,解析AIV适应哺乳动物并获得在哺乳动物神经嗜性和致病性的分子机制具有重要意义。低致病性H9N2亚型AIV在家禽中广泛流行,并且近年来表现出逐渐增强的哺乳动物感染特性;H10N7亚型AIV可引起家禽的发病,并导致了多起人感染病例的出现。这些AIV能否获得对哺乳动物的神经嗜性和致病性,以及其获得感染与致病的分子机制尚不清楚。为解决该问题,本研究中,以H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Shandong/16/05(SD16)和H10N7亚型禽流感病毒A/mallard/Beijing/27/2011(BJ27)为模式研究毒株,以Balb/c小鼠为哺乳动物模型,分别在小鼠体内进行连续的肺-肺传代。鼠适应性SD16病毒和BJ27病毒分别在传至第13代和第9代时,感染小鼠在5天内全部死亡。之后,我们将获得的第13代鼠适应H9N2病毒和第9代鼠适应H10N7病毒在MDCK细胞上进行3轮噬斑纯化,并将纯化后的单克隆病毒分别命名为SD16-MA和BJ27-MA。通过对鼠适应毒的生物学特性进行研究发现,SD16-MA和BJ27-MA对小鼠的致病性、在小鼠体内的复制力以及在A549细胞和N2a细胞中的生长复制能力均显著提高;对SD16-MA和BJ27-MA进行Sanger测序及序列比对分析发现,与野生型SD16病毒相比,SD16-MA在5个病毒蛋白上出现8个保守氨基酸位点的变异,分别为PB2 M147L、PB2 V250G、PB2 E627K、PB1 Y657H、HAL226Q、HAR211K、M1R210K 和 NS1L214F;与野生型 BJ27 病毒相比,BJ27-MA在3个病毒蛋白上出现5个保守氨基酸位点的变异,分别为PB2 E158G、PB2 M631L、HAG218E、NA K110E和NA S453I。对两株鼠适应病毒变异基因片段进行比较分析发现,SD16-MA和BJ27-MA同时在PB2和HA蛋白上发生了适应性突变,说明病毒血凝素蛋白HA和聚合酶蛋白PB2在AIV跨种间感染中发挥重要作用。进一步结构分析发现PB2 E627K与PB2 M631L的位置较接近,均位于PB2-PB1和PB2-NP结合区,对AIV提高哺乳动物细胞中的聚合酶活性起重要作用;HAL226Q和HAG218E同时位于HA1区域的220-loop,均可以影响病毒的唾液酸受体结合特性,表明病毒聚合酶PB2以及受体结合位点区域的变异对AIV的跨种间感染与复制具有重要作用。为解析鼠适应病毒的神经感染特性和致病性,本研究利用反向遗传操作技术,构建了 SD16和BJ27病毒的反向遗传操作系统,分别以SD16和BJ27病毒为骨架病毒,替换鼠适应毒的突变基因片段,拯救得到5株单基因片段替换的H9N2重组病毒,以及6株单基因和双基因片段替换H10N7重组病毒,并评价了重组病毒对小鼠的神经嗜性。结果表明,适应性突变PB2M147L、PB2 V250G和PB2 E627K以及HA L226Q和HA R211K对H9N2病毒获得在小鼠的神经嗜性起重要作用;而在H10N7病毒中,只有当PB2E158G和PB2M631L以及NAK110E和NAS453I协同作用时,H10N7病毒才能够获得对小鼠的神经嗜性。为进一步探究鼠适应毒对小鼠中枢神经系统感染与入侵的途径,本研究将rSD16-MA感染小鼠,感染后每日检测小鼠鼻粘膜、嗅球、嗅神经节、三叉神经节、迷走神经节、交感神经节、大脑及小脑等部位病毒抗原分布。免疫组化染色结果表明,病毒抗原顺次在鼻粘膜、嗅球、嗅神经节和三叉神经节中检测到,之后在大脑和小脑中广泛分布,表明H9N2AIV可以利用嗅神经和三叉神经的神经通路入侵小鼠的中枢神经系统,而3dpi和5dpi均未在血液中检测到病毒,证明H9N2 AIV不能通过血行性路径感染小鼠的中枢神经系统。AIV对小鼠中枢神经系统的感染还依赖于病毒与宿主蛋白的互作,脆性X智力低下蛋白(FMRP)是一种mRNA结合蛋白,主要分布在神经细胞,其可以通过与H1N1病毒(PR8)互作,促进病毒的复制。鉴于FMRP的功能和组织分布,我们推测该蛋白有可能在AIV感染小鼠神经系统过程中发挥重要功能。为了探究FMRP在AIV入侵小鼠中枢神经系统过程中的作用,本研究探讨了 H9N2鼠适应毒在野生型(FMRP+/+)及FMRP基因缺失(FMRP-/-)小鼠中枢神经系统中的复制能力,发现当FMRP基因缺失后,病毒无法在小鼠脑部有效感染和复制,直接证明了 FMRP在AIV感染小鼠中枢神经系统中的重要作用。为了进一步探究FMRP对AIV在体外培养神经细胞中复制能力的影响,本研究体外分离FMRP+/+和FMRP-/-乳鼠大脑皮层神经细胞,并检测了 H9N2鼠适应毒在FMRP+/+和FMRP-/-神经元细胞中的生长复制能力以及病毒蛋白合成水平。结果显示,与FMRP+/+神经元细胞相比,病毒在FMRP-/-细胞中的复制力以及病毒蛋白合成能力均显著降低。进一步研究发现,SD16-MA的PB2和HA中的适应性突变可以通过提高病毒的聚合活性、病毒在神经细胞中的核输入能力以及病毒对神经细胞的感染特性,增强病毒在小鼠神经瘤母细胞N2a中NP蛋白的表达水平,NP蛋白表达水平的提高有助于由FMRP和NP互作介导的RNP的合成以及RNP的核输出,进一步促进病毒在神经细胞中的转录和复制。H9N2 AIV和H10N7 AIV在小鼠体内传代后获得了对小鼠的高致病性,之前已有研究对H9N2鼠适应病毒对哺乳动物致病性增强的机制进行了深入探究,本研究重点解析了 H10N7鼠适应病毒对小鼠致病性增强的分子机制。利用反向遗传技术,本研究拯救得到3株单基因片段替换和5株单个氨基酸位点突变H10N7重组病毒,并评价了重组病毒对小鼠的致病力、体内外复制力、293T细胞中的聚合酶活性及神经氨酸酶活性。结果显示,PB2M631L和PB2E158G变异通过提高病毒的聚合酶活性、NAK110E变异通过提高病毒的NA酶活性,对提高病毒的哺乳动物适应性和致病性起重要作用,其中PB2M631L在这一过程中起决定性作用,是一新发现的哺乳动物适应性分子标志。综上所述,本研究揭示了 H9N2和H10N7亚型AIV鼠适应病毒对小鼠神经嗜性和致病性增强的分子机制,证明了病毒PB2、HA以及NA蛋白上的适应性突变对于AIV在小鼠中的神经嗜性起重要作用;H9N2AIV可以通过嗅神经和三叉神经入侵小鼠中枢神经系统,且宿主蛋白FMRP在AIV感染小鼠中枢神经系统过程中扮演重要角色;H10N7 AIV中的PB2 M631L是一个新发现的哺乳动物适应性分子标志。该研究揭示了 AIV适应哺乳动物并导致神经系统感染的分子机制,对评估AIV在哺乳动物以及人群中的危害和流行潜力提供了理论参考。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】