杀鱼爱德华氏菌中全局调控因子EsrB调控毒力因子表达的分子机制

发布时间：2018-01-23 12:08

  本文关键词： 杀鱼爱德华氏菌 esrB Ⅲ型分泌系统 效应蛋白 转录组测序 晶体结构　出处：《华东理工大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是一种广宿主的革兰氏阴性致病菌,能造成许多重要经济鱼种的出血性败血症,更好地了解其致病机制将有助于开发安全高效的疫苗来防控爱德华氏菌病。目前已经鉴定出多个毒力因子参与到E.piscicida的致病过程中,其中Ⅲ型分泌系统(T3SS)协助其逃避宿主吞噬细胞的杀伤并在胞内增殖,Ⅵ型分泌系统(T6SS)也协助其在宿主体内定植。EsrA-EsrB双组份系统对T3SS和T6SS有重要的调控作用,但EsrB在E.piscicida中对毒力以及生理的全局调控作用尚不清楚。本课题对比了E.piscicida野生株和△esrB缺失株在不同条件下的转录谱,分析了差异表达基因,寻找受EsrB调控的宿主适应性及毒力相关基因。我们鉴定了 6个新的效应蛋白,它们通过T3SS转运至宿主细胞中,与病原菌的定植及毒力相关。在此基础上,我们鉴定了 2个受EsrB直接调控的基因,在它们的启动子区域发现了结合EsrB的区域(Binding box)。我们还利用X射线衍射成功解析了 EsrB C端DNA结合结构域的晶体结构。当EIB202野生株培养在DMEM培养基中时,T3SS和T6SS的7个胞外蛋白被分泌,而?esrB菌株培养在DMEM中以及野生株培养在LB中时,相关蛋白不分泌,表明EsrB在DMEM条件下激活T3SS和T6SS的表达或分泌。我们对培养在DMEM和LB中的野生株以及?esrB菌株进行转录组测序,104个基因受EsrB和DMEM共上调,195个基因受共下调,其中T3SS基因簇35个基因(ETAE_0854-ETAE_0888)中的30个以及T6SS基因簇全部16个基因(ETAE_2428-ETAE_2443)显著上调超过4倍,占共上调基因40%以上。对295个差异表达基因进行功能聚类分析发现,胞内运输及分泌相关基因显著上调,包括T3SS、T6SS和铁摄取相关基因;能量产生、物质代谢、蛋白质合成以及细菌运动相关基因被显著抑制,包括溶血素、粘附素和外膜蛋白。另外,大质粒PEIB202不参与细菌的毒力及定植,其中编码的抗生素抗性基因及Ⅳ型分泌系统(T4SS)相关基因的表达受EsrB和LB培养条件激活。上述结果表明EsrB在该菌的毒力和生理适应过程中起重要作用。本课题通过胞外蛋白以及TEM-1报告系统对104个共上调基因进行转运分析,9个候选效应蛋白被分泌至胞外并被转运至HeLa细胞中。EseG(ETAE_0866)是已知的T3SS效应蛋白,介导微管解聚。EseJ(ETAE_0888)是新近鉴定的T3SS效应蛋白,抑制细菌粘附但协助其在EPC中增殖。EseH(ETAE_1757)是最近报道的T3SS效应物,定位于宿主细胞核并抑制宿主JNK/MAPK途径的磷酸化。ETAE_1586含有木瓜蛋白酶折叠毒素(papain fold toxin)功能域,可能抑制宿主的炎症反应;ETAE_1604含有胞外转肽酶功能域,可能参与蛋白质的分泌和转运等过程;ETAE_2186属于硫氧还蛋白;ETAE_2188含有DUF1471功能域;EvpJ(ETAE_2438)含有PAAR结构域,可能协助T6SS分泌过程;ETAE__3282没有保守功能域,功能未知。9个蛋白的转运都依赖于T3SS,而T6SS影响EvpJ和ETAE_2188的转运。EIB202侵染巨噬细胞J774A.1以及大菱鲆时,9个候选基因也受到EsrB上调。CI-seq实验发现,?eseJ菌株的体内存活能力在感染后第3天不显著地降低,而在第7天显著降低,表明EseJ协助细菌在宿主体内的定植过程。9个效应蛋白缺失的菌株(9?)与?esrB、AT3SS和AT6SS菌株一样,体内存活能力显著下降,进一步,9A菌株表现出强减毒,免疫大菱鲆之后可以提供较高的免疫保护力。EMSA实验发现EsrB和EsrBc(142～214 aa)直接结合esrC和esaM的启动子,而不结合esaB和eseJ的启动子。通过Footprinting实验,我们发现EsrB结合box与SsrB识别序列的7'-4-7"回文结构十分相似。X光衍射显示EsrBc由3个α螺旋(H1,H2和H3)组成,同源的NarL家族其他蛋白则均由4个α螺旋组成。EsrBc的H1和H2与家族其他蛋白相似,但H3更长。我们推测EsrBc结合DNA之后可能发生构象变化,形成H4二聚化结构。基于已报道的NarLc-DNA和DosRc-DNA结构,我们预测氨基酸残基Lys181、Glu184和Leu188负责协助EsrBc结合DNA,而Thr182负责与磷酸骨架非特异性结合。
[Abstract]:In this paper , we have identified six new effector proteins , which have been involved in the pathogenic process of E . piscicida , and we have identified six new effector proteins , which are related to the host adaptability and virulence of EsrA - EsrB . We identified two genes which are directly regulated by EsrB . The results showed that EsrB was not involved in the virulence and colonization of bacteria . The results showed that EsrB and Esrbc ( 142 - 214 aa ) were directly bound to esrB , AT3SS and AT6SS .

【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S941.4

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本文编号：1457506