腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立和溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的构建

发布时间：2018-02-04 12:44

  本文关键词： 内部核糖体进入位点 类弹性蛋白 柯萨奇腺病毒受体 重组腺病毒 人溶菌酶 牛γ干扰素　出处：《扬州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：腺病毒(adeno virus, Ad)载体具有感染宿主范围广、转导效率高和不易引起插入突变等优点,因此广泛应用作基因治疗和基因工程疫苗的载体,但现有的重组腺病毒制备方法具有费时、成本高、不易规模化等缺点。受体结合捕获(receptor-binding capture)技术能从组织和环境样品中浓缩病毒,将其与PCR等技术相结合可用于病毒的浓缩和环境监测。类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide, ELP)是一种人工合成的蛋白聚合物,具有温度敏感相变特性,即随着溶液温度的变化由可溶性状态变为不可溶凝聚状态,已广泛用作重组蛋白的纯化标签。将ELP的温度敏感相变特性与柯萨奇病毒-腺病毒受体(coxsachievirus and adenovirus receptor, CAR)结合腺病毒的特异性相结合,用重组大肠杆菌表达的ELP-CAR融合蛋白有望建立简单、快速、经济的腺病毒浓缩与纯化方法。奶牛乳房炎严重地制约着奶牛业的发展,目前一般采用抗生素防治。但奶牛乳房炎的病原种类复杂,中小型奶牛场一般不进行病原菌鉴定和药物敏感性检测,长期、盲目使用抗生素不仅治疗效果不佳,而且药物残留和耐药菌株日益严重。溶菌酶是一种细胞壁溶解酶,对多种革兰氏阳性菌具有直接溶菌作用,在补体等体液因子参与下对革兰氏阴性菌也有一定的溶菌作用,表达溶菌酶的重组质粒对奶牛乳房炎具有良好的防治效果。γ干扰素(IFN-γ)是一种高活性、多功能细胞因子,能提高机体的免疫和抗感染能力,重组大肠杆菌表达的牛丫干扰素对奶牛乳房炎也有一定的治疗效果。因此,溶菌酶与BoIFN-γ共表达重组腺病毒对奶牛乳房炎可能具有更好的治疗效果。一、ELP-CAR融合蛋白的表达与纯化：依次将ELP、CAR间隔区和CAR D1区编码序列插入原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-ELP-CAR转化BLR(DE3)大肠杆菌,在20℃利用IPTG诱导融合蛋白表达,在优化条件下利用ELP的温度敏感逆向相变循环(ITC)纯化融合蛋白。结果显示：ELP-CAR融合蛋白在重组大肠杆菌中获得可溶性表达,第一轮逆向相变循环获得的融合蛋白纯度为89.4%,再次逆向相变循化后的纯度达94.5%。Western-blot鉴定结果显示：纯化的ELP-CAR融合蛋白能被CAR抗体识别。这些实验结果表明,本研究成功纯化出了ELP-CAR融合蛋白。二、腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立：将rAd-GFP与ELP-CAR融合蛋白混合,4℃孵育1h后用ITC沉淀,经PCR检测证明rAd-GFP能被ELP-CAR融合蛋白结合和沉淀。将不同浓度ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP在不同温度、pH条件下孵育不同时间,用ITC回收结合的rAd-GFP,病毒滴定结果显示120mg/ml的ELP-CAR与rAd-GFP在18℃、pH7.0孵育30min的结合效率最佳。将结合融合蛋白的rAd-GFP在不同温度、pH条件下洗脱不同时间,病毒滴定结果显示最佳洗脱条件为20℃、 pH9.0、10min。在优化条件下分别从rAd-GFP感染细胞培养上清和裂解细胞中纯化重组腺病毒,结果显示rAd-GFP的获得率分别为76.2%和73.3%。在优化条件下洗脱从rAd-GFP感染细胞培养上清和裂解细胞纯化的rAd-GFP,结果显示回收率分别30.6%和34.5%,与高压液相色谱和氯化铯密度梯度的回收率相当。分别用结合ELP-CAR融合蛋白和洗脱的rAd-GFP感染CAR阳性PK-15细胞、CAR弱阳性CHO-K1细胞和CAR阴性NIH 3T3细胞,荧光显微镜观察结果显示洗脱和未洗脱重组腺病毒均能感染PK-15和CHO-K1细胞,不能感染NIH 3T3细胞。用含或不含10%犊牛血清的细胞培养液稀释洗脱和未洗脱重组腺病毒,分别感染PK-15和CHO-K1细胞,流式细胞仪计数结果表明洗脱和未洗脱重组腺病毒均能有效转导PK-15细胞,而且受犊牛血清的影响较小；对于CHO-K1细胞,洗脱腺病毒的转导效率显著高于未洗脱重组腺病毒,而且受犊牛血清的影响较大。将不同浓度rAdv-GFP接种自来水和PBS,然后加入ELP-CAR融合蛋白,孵育一定时间后用ITC回收,荧光定量PCR检测结果表明ELP-CAR融合蛋白从PBS和自来水中捕获病毒的效率分别为74%和63%。三、双表达腺病毒载体的构建：用化学合成或PCR扩增脑心肌炎病毒(EMCV)、Gtx同源异型蛋白(Gtx)、人蛋白翻译起始因子4G (EIF4G)、人胶原诱导蛋白(hVCIP)和鼠胶原诱导蛋白(mVCIP)的内部核糖体进入位点(IRES),测序鉴定正确后分别插入腺病毒载体pShuttle-CMV,构建获得双表达腺病毒载体pShuttle-IRES.分别以含人溶菌酶(hLYZ)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组质粒为模板,用PCR扩增LYZ和GFP基因,分别插入pShuttle-IRES载体IRES位点的上游和下游,获得5种重组载体pShuttle-LYZ-IRES-GFP。分别用脂质体转染法将5种重组载体转染PK15、AAV-293、 CHO-K1和MDBK细胞,用流式细胞术等检测GFP阳性细胞及荧光强度,结果表明EIF4G IRES能在四种不同细胞中有效表达下游GFP基因。四、溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的制备及表达检测：根据BoIFN-y编码序列设计引物,两端分别引入XhoⅠ、HindⅢ酶切位点,以pGEX-IFNγ质粒为模板PCR扩增BoIFN-γ序列,PCR产物经XhoⅠ和HindⅢ酶切消化后,取代pShuttle-LYZ-EIRES-GFP中的GFP编码序列,获得共表达重组腺病毒载体pShuttle-LYZ-EIRES-IFNy,用常规构建方法转化大肠杆菌获得同源重组质粒,转染AAV-293细胞获得重组腺病毒。电镜观察结果表明：重组病毒rAd-LYZ-IRES-IFN具有典型的腺病毒形态,PCR能从其基因组DNA中扩增到预期的461 bp hLYZ基因片段和509bp BoIFN-y基因片段。用重组腺病毒感染PK-15细胞,经RT-PCR和间接免疫荧光法检测证明,重组腺病毒能正确表达hLYZ和BoIFNy蛋白。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 刘根梅;罗满林;陈瑞爱;陈矩豪;裴党帅;;猪γ干扰素基因重组腺病毒的构建与鉴定[J];中国兽医杂志;2011年05期

2 苏永良;刘堰;;力生长因子、E肽重组腺病毒的构建及其在神经细胞中的表达[J];西南大学学报(自然科学版);2013年12期

3 何雷;张彦明;向华;唐青海;徐彦召;杨小云;王静;代晨;;表达猪白介素2基因重组腺病毒的构建及其免疫增强作用[J];西北农业学报;2010年11期

4 徐娜;李宝玉;柳纪省;;猪繁殖与呼吸综合征病毒M+N基因重组腺病毒载体的构建[J];生物技术通报;2010年10期

5 汪思钧;廖明;任涛;张春红;黄忠;曹汉威;;表达猪流感病毒血凝素基因的重组腺病毒的构建及免疫原性分析[J];畜牧兽医学报;2007年01期

6 王声会;黄毓茂;焦茂兴;;猪α干扰素重组腺病毒的构建与鉴定[J];广东农业科学;2007年09期

7 杜以军;姜平;李玉峰;王先炜;;猪α干扰素重组腺病毒的构建及其抗口蹄疫病毒活性研究[J];Virologica Sinica;2006年04期

8 云涛;倪征;余斌;陈柳;华炯钢;王根荣;刘光清;;表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M融合蛋白的重组腺病毒的构建及其对小鼠的免疫原性[J];生物工程学报;2009年04期

9 孙栋;郭鑫;杨汉春;陈艳红;查振林;;表达猪CD3 ε蛋白重组腺病毒的构建及免疫原性测定[J];中国兽医杂志;2008年06期

10 杜以军,姜平,杨晓玮,汤景元,李玉峰,李永东;猪口蹄疫病毒多抗原表位重组腺病毒的构建与鉴定[J];中国病毒学;2005年05期

相关会议论文 前10条

1 梁绍燕;金先庆;罗庆;;结缔组织生长因子的克隆及其重组腺病毒的构建[A];中国西南地区第九届小儿科学术会议论文汇编[C];2008年

2 熊俊;孙擎;胡凯猛;冀凯宏;刘厚奇;;重组腺病毒pAdEasy-1/pAdTrack-CMV-hSnaill质粒的构建[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

3 张春红;黄忠;阮良基;曹汉威;;含猪生长激素基因的重组腺病毒的构建[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年

4 李玉峰;姜平;;猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组腺病毒的构建与鉴定[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集（上）[C];2003年

5 李巧;王志刚;冉海涛;钟世根;李兴升;;载重组腺病毒Ad-EGFP/HIF-1α的超声造影剂的制备以及超声辐照对腺病毒活性的影响[A];中国超声医学工程学会第八届全国腹部超声学术会议论文汇编[C];2010年

6 胡波;王芳;;兔病毒性出血症病毒结构基因在重组腺病毒系统中的表达和鉴定[A];2007中国兔文化节“康大杯”兔业优秀科技论文、科普作品集[C];2007年

7 靳继德;刘铖;哈小琴;李元敏;吴祖泽;;携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒对大鼠局灶性脑缺血治疗的实验研究[A];全面建设小康社会：中国科技工作者的历史责任——中国科协2003年学术年会论文集（上）[C];2003年

8 祝成亮;鲁敏翔;胡汉宁;刘芳;周新;;热休克蛋白72重组腺病毒包装及其对细胞凋亡的影响[A];第四届全国血脂分析与临床学术研讨会暨第九届全国脂蛋白学术会议论文汇编[C];2008年

9 郭浩;彭毅志;辛海明;;小鼠CCR7基因重组腺病毒的构建与鉴定[A];第八届西南五省一市烧伤整形学术会议暨贵州省医学会烧伤整形分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年

10 徐琳;陈杰;麻晓峰;高下;;构建人pAdeasy-NT3-DsRed2融合基因重组腺病毒[A];中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编（下）[C];2007年

相关重要报纸文章 前1条

1 吴一福;重组腺病毒核糖核酸酶载体问世[N];中国医药报;2007年

相关博士学位论文 前10条

1 杨国华;重组腺病毒Ad-Apoptin-hTERT-E1a对结肠癌抑制作用的实验研究[D];吉林大学;2015年

2 郭小娟;疫苗载体人腺病毒41型和5型在小鼠的免疫效果评价和体内分布研究[D];中国疾病预防控制中心;2015年

3 吴倩;腺病毒快速浓缩与纯化方法的建立和溶菌酶与γ干扰素共表达重组腺病毒的构建[D];扬州大学;2016年

4 李凯;汉滩病毒多组分新型重组腺病毒的制备及免疫学特性研究[D];第四军医大学;2013年

5 陈漉;特异性抗肿瘤重组腺病毒抑癌作用研究[D];吉林大学;2009年

6 李文辉;基于重组腺病毒的狂犬病毒基因工程疫苗研究[D];中国协和医科大学;2001年

7 陶陶;重组腺病毒HIF-1α基因治疗脑缺血的实验研究[D];重庆医科大学;2005年

8 马臻;HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及对肝细胞生物学行为的影响[D];重庆医科大学;2006年

9 周继章;鸡源鹦鹉热衣原体主要外膜蛋白（MOMP）基因重组腺病毒活载体疫苗研究[D];中国农业科学院;2006年

10 王澜;重组腺病毒介导人野生型p53、GM-CSF和B7-1基因对恶性肿瘤生物治疗的临床前研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 薛晓娟;表达水泡性口炎病毒G蛋白重组腺病毒的构建与免疫原性分析[D];中国农业科学院;2015年

2 许晗;共表达PCV2 Cap蛋白和免疫增强因子InvC重组腺病毒甚因工程疫苗的研究[D];西北农林科技大学;2015年

3 蒋丹;Betatrophin重组腺病毒过表达载体的构建[D];江苏大学;2016年

4 张磊;2型糖尿病大鼠模型的建立及携带adipsin基因重组腺病毒治疗2型糖尿病大鼠模型的初步研究[D];北京协和医学院;2016年

5 邓莉;SCAP重组腺病毒的构建及对软骨细胞增殖与凋亡的实验研究[D];重庆医科大学;2016年

6 刘凯;乙脑E基因和猪白细胞介素6基因重组腺病毒的构建与初步免疫研究[D];四川农业大学;2013年

7 唐丹;嗜肝细胞重组腺病毒基因治疗载体的构建[D];重庆医科大学;2010年

8 焦月盈;表达人呼吸道合胞病毒结构蛋白的重组腺病毒及杆状病毒的构建与鉴定[D];北京交通大学;2011年

9 邱亚;重组腺病毒rhAdEasy-nm23-H1的构建与鉴定及体外表达的实验研究[D];昆明医学院;2006年

10 苏永良;力生长因子、E肽重组腺病毒的构建及其在神经细胞中的表达[D];西南大学;2013年

，

本文编号：1490241