Rspo1和β-catenin在罗非鱼卵巢分化、维持过程中的功能研究

发布时间：2018-02-11 00:02

本文关键词： Rspo1 β-catenin 敲降卵巢分化延迟减数分裂雄性化尼罗罗非鱼　出处：《西南大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：长期以来,性别决定和性别分化在生殖生物学领域一直备受关注。曾经有一段时间科学家认为哺乳动物中卵巢的发育是一个默认和被动的过程。但最近对哺乳类研究发现,雌性性别决定也是由Foxl2、R-spondin1(Rspo1)、Wnt4和β-catenin等转录因子严格控制之下的多基因参与的分子级联。哺乳动物性别决定是一个雄性的(Sry/Sox9/Fgf9)和雌性的(Rspo1/Wnt/β-catenin和Foxl2)信号通路的拮抗过程。表达数据暗示Rspo1/Wnt/β-catenin信号通路可能参与炓鲷、青溕、斑马鱼、罗非鱼等硬骨鱼类的性腺分化。硬骨鱼类同时存在两个β-catenin(简写为β-cat)基因,即β-cat1,β-cat2,并且它们编码的氨基酸在N端以及中间的犰狳区域都很保守,而C端转录激活域差异较大,这种C端转录激活域的差异对β-cat转录激活靶基因能力有无影响,两个β-cat在硬骨鱼类性腺发育过程中又分别扮演什么角色都不清楚。为了更直接、更深入地研究Rspo1/β-cat信号通路在硬骨鱼类雌性性别分化过程中的作用,我们进一步研究了罗非鱼Rspo1、β-cat1和β-cat2基因在性别分化早期的表达模式,借助TopFlash荧光素酶报告体系研究Rspo1、β-cat1和β-cat2激活靶基因能力,最后通过TALEN基因组编辑技术,从基因缺失的角度深入研究Rspo1/β-cat信号通路的功能。同时,我们表达并纯化出该信号通路抑制因子Dkk1的重组蛋白,并用纯化的Dkk1和该信号通路的化学抑制剂FH535分别离体孵育罗非鱼卵巢,检测相关基因表达变化。本研究是首次在硬骨鱼类通过基因敲降的在体实验和离体孵育相结合的方式,直接证明该信号通路在雌性性别分化过程中的重要作用。具体结果如下:1.鉴于硬骨鱼类两个β-cat氨基酸序列在C端转录激活域差异较大,我们分别将β-cat1缺失C端序列和β-cat2末端加入VP16激活域序列连入pcDNA3.1(β-cat1-C--pcDNA3.1,β-cat2-VP16-pcDNA3.1),借助TopFlash荧光素酶报告体系,探讨β-cat1和β-cat2激活靶基因的能力。结果发现β-cat1可以激活TopFlash荧光素酶表达,而Rspo1和β-cat2不能。但Rspo1能够增强β-cat1激活的TopFlash荧光素酶表达。β-cat2却可以通过与β-cat1发生相互作用而增强β-cat1激活的TopFlash荧光素酶表达;β-cat2-VP16可以激活荧光素酶的表达,而β-cat1-C-转录激活能力大大降低。2.荧光定量PCR结果显示Rspo1、β-cat1和β-cat2在卵巢中从孵化后20天开始上调,结合前期的原位杂交和免疫组化数据,我们推测Rspo1、β-cat1和β-cat2可能参与罗非鱼雌性减数分裂过程。3.通过TALEN基因组编辑技术敲降Rspo1。与对照组相比,Rspo1敲降XX罗非鱼性腺在孵化后2个月发育延迟,生殖细胞停留在卵原细胞阶段,无卵母细胞。同时免疫组化实验表明,与对照相比,Rspo1敲降性腺中Vasa阳性细胞减少,但Rspo1敲降不影响雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺体细胞表达;到孵化后6个月,Rspo1敲降个体性腺发育得到恢复,与对照相比却可以检测到雄激素合成酶Cyp11b2和雄性支持细胞标记因子Dmrt1的表达,同时血清中雄激素(11-KT)水平显著上调,而雌激素(E2)水平并没有发生变化。4.在孵化后60天,对照组卵巢中出现I、II时相卵母细胞,在β-cat1或β-cat2敲降60天的XX性腺,无I、II时相卵母细胞的形成,生殖细胞停留在卵原细胞时期。免疫组化表明,与对照相比,在雌性个体敲降β-cat1或β-cat2不影响雌激素合成酶Cyp19a1a在性腺体细胞的表达;3月龄的β-cat1或2敲降雌鱼出现I、II时相的卵母细胞,而性腺表现为雄性因子Dmrt1、Cyp11b2阳性,而对照卵巢检测不到Dmrt1、Cyp11b2;到6月龄,β-cat1或2敲降雌鱼卵巢发育赶上对照组,但此时的卵巢仍表现为Cyp11b2阳性,同时血清中雄激素水平比雌性对照高,但雌激素水平与对照没差异。荧光定量PCR和Western blot结果表明,与对照比Foxl2、Dmrt1、Cyp11b2在β-cat1或2敲降雌鱼性腺中上调,Cyp19a1a表达没发生变化。5.当用30μg/ml Dkk1重组蛋白或者50μM化学抑制剂FH535孵育180天罗非鱼卵巢4天后,均引起β-cat1和2表达下调,foxl2、dmrt1、cyp11b2表达上调,而cyp19a1a表达没发生变化。同时,免疫组化显示,6月龄罗非鱼卵巢经Rspo1/Wnt/β-catenin信号通路抑制剂FH535离体孵育4天后Cyp19a1a表达没发生变化,Foxl2、Dmrt1和Cyp11b2表达上调。综上,在硬骨鱼类中Rspo1可以激活β-cat1介导的信号通路,并在卵巢分化和维持中起重要作用;硬骨鱼类中β-cat1和β-cat2通过协同作用发挥作用;这个信号通路在雌性个体中通过抑制雄性基因的表达和雄激素的合成而维持卵巢的雌性特征;尽管Rspo1、β-cat1或β-cat2敲降和离体孵育实验中foxl2上调,但是cyp19a1a表达没有发生变化,暗示硬骨鱼类中很有可能存在一条独立于雌激素合成的Foxl2通路。
[Abstract]:In order to study the role of Rspo1 / 尾 - cat1 and 尾 - cat2 in the process of sex differentiation , we further studied the role of Rspo1 , 尾 - cat1 and 尾 - cat2 in the process of sex differentiation of female ( Sry / Sox9 / FAD9 ) and female ( Rspo1 / Wnt / 尾 - catenin and Foxl2 ) . There was no change in the expression of estrogen synthase Cyp19a1a in the ovary of the control group . The expression of Cyp19a1a in the ovary of the control group was higher than that of the control group , but the expression of the estrogen ( E2 ) was not changed .

【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

【相似文献】