牛带绦虫转录组测序分析及其乙酰胆碱酯酶的研究

发布时间：2018-02-22 07:58

  本文关键词： 牛带绦虫 转录组 密码子 乙酰胆碱酯酶 毕赤酵母表达系统 同源模建 配体虚拟筛选　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：牛带绦虫是一种重要的人兽共患寄生虫。成虫寄生虫于人体引起绦虫病,幼虫则寄生于牛的横纹肌内引起牛囊尾蚴病。据统计,全球每年大约有5000万人被牛带绦虫感染,主要集中在非洲、中东地区、亚洲、欧洲的一些国家。该病原给全球畜牧业造成的经济损失巨大,也对人类健康构成严重威胁。目前,由于牛带绦虫的可用的生物分子数据较少,大大限制了人们对该病原的科学研究和新型药物的开发。本论文对该绦虫进行了转录组测序,并以转录组数据为基础开展了相关工作。1.利用Illimina Hi Seq TM2000第二代测序技术对牛带绦虫囊尾蚴进行了转录组测序。测序共获得了52829606高质量序列,并通过拼接组装得到了91487条Unigene(平均长度为2122bp)。利用几种蛋白质公共数据库(Nr,Swiss-prot,GO,COG和KEGG数据库)对Unigene进行了注释。结果显示,共有59262条Unigene(占总Unigene数量的64.77%)得到了功能注释。同时,我们鉴定出了大量的分子标记,包括12902个SNP(single-nucleotide polymorphisms)位点和10017个SSR(simple sequence repeats)序列.2.利用测序获得的牛带绦虫转录组数据和其他五种绦虫(猪带绦虫、亚洲带绦虫、微口膜壳绦虫、细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫)的基因组数据,我们对六种绦虫的密码子使用模式和影响因素进行了比较分析。结果显示,除了微口膜壳绦虫外,其他五种绦虫具有相似的密码子使用模式,这些绦虫的密码子都倾向于G或C结尾。相反,微口膜壳绦虫基因的密码子第三位倾向于以A或T结尾。ENC-plot、PR2和中性分析结果表明六种绦虫在进化过程中受到了突变和自然选择两种压力。除了这两种压力外,六种绦虫的密码子使用偏性还受到了GC含量、基因表达水平、基因长度和编码蛋白的亲水性及芳香性等多种因素的影响。通过卡方检验,我们鉴定出了每种绦虫的最优密码子,这些密码子对于外源基因表达、分子进化研究具有重要意义。3.通过分析转录组数据,筛选出对其生长发育至关重要的乙酰胆碱酯酶基因,并对其进行了克隆和毕赤酵母表达等一系列工作。序列分析表明,ACh E1和ACh E2基因编码的氨基酸序列与猪带绦虫ACh E氨基酸序列相似性最高,均在80%以上,而与人类的ACh E基因序列相似性仅有37%,这种寄生虫与宿主之间的基因序列显著差异将有助于开发新的治疗绦虫病的药物。荧光定量PCR实验结果显示,ACh E1和ACh E2基因在成虫和囊尾蚴时期均有表达,且成虫时期表达量更高。将纯化后的重组蛋白ACh E1和ACh E2免疫新西兰大白兔,制备多抗进行组织定位,结果表明,ACh E1和ACh E2主要分布在卵巢,而在间质以及体壁中分布不明显,表明乙酰胆碱酯酶与虫体的生殖发育相关。酶活性分析显示,当重组酶的浓度为0.5 mg/m L,底物浓度为0.8 mmol/L,p H为7,温度为35℃时,酶活性最高。4.采用同源模建的方法对牛带绦虫乙酰胆碱酯酶结构进行了预测,然后基于结构的虚拟筛选方法对牛带绦虫乙酰胆碱酯酶抑制剂进行了筛选,得到了15个具有潜在ACh E抑制活性的小分子化合物(ACh E1和ACh E2各15个),这些小分子结构相似,多数为狭长结构,并含有芳香环结构、疏水基团和氮原子、氯原子和溴原子等,主要以氢键、π-π堆积和疏水作用与酶活性部位结合。
[Abstract]:鐗涘甫缁﹁櫕鏄�涓�绉嶉噸瑕佺殑浜哄吔鍏辨偅瀵勭敓铏，

本文编号：1523921