控制水稻粒型基因GLW2的功能验证及调控机理

发布时间：2018-02-24 01:15

  本文关键词： 粒型 产量 OsmiR396c 基因功能 基因互作 分子调控模式 产量潜力　出处：《四川农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：水稻是我国重要的粮食作物,其产量高低涉及粮食安全。水稻产量构成要素主要包含有效穗数、穗粒数、粒重、结实率等,其中粒重主要是受粒型和灌浆影响。尽管已经有一些粒型相关基因被报道,但其调控粒型的分子机制仍不十分清楚。本实验室在育种过程中发现了一份育种中间材料307R,其主要特征为籽粒明显增大,千粒重达64g。在前期的研究中,通过系统的遗传分析确定307R中存在一个显性主效基因调控籽粒粒型及粒重；构建了以IR24, MH63和527R为背景高世代回交的近等基因系；通过细胞学观察发现307R大粒性状是由于细胞的增大和数量增加所致；同时通过构建BC3F2群体及重组纯合体分析将该基因定位于2号染色体长臂端15.3kb范围内,确定编码生长发育调控因子家族蛋白OsGRF4为候选基因,并将该基因命名为GLW2 (Grain Length and Width 2)。本研究在上述基础上对GLW2的功能进行了验证,并确定了该基因的上游调控因子和下游互作蛋白,基本明确了GLW2控制水稻粒型粒重的遗传机理,结果如下：1、以2x35S为启动子,对OsGRF4进行过量表达。结果显示,过表达阳性植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著高于对照；细胞学观察发现,过表达阳性植株外稃表皮细胞明显大于对照。利用CRISPR/Cas9技术对NIL-527R中OsGRF4进行基因编辑,结果表明基因敲除植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著低于对照；细胞学观察发现,基因敲除植株外稃表皮细胞明显小于对照。上述实验表明,OsGRF4可以通过控制细胞大小调控水稻籽粒粒长、粒宽及千粒重,OsGRF4即为调控307R籽粒粒型的主效基因GLW2。2、亚细胞定位结果显示OsGRF4定位于细胞核；同时在酵母细胞中OsGRF4具有转录激活活性,其活性区域位于OsGRF4 C端,这与OsGRF4作为一个转录因子生化功能相符合。3、分析发现GLW2含有与OsmiR396互补的序列,且大粒基因相对于小粒基因的突变位点刚好位于OsmiR396与OsGRF4的预测的结合区域。同时原位杂交显示,OsmiR396c和OsGRF4均在在颖壳中表达。对307R穗发育的不同时期的各个主要组织中GLW2表达量进行分析,相较于OsGRF4在日本晴中的表达模式,发现OsGRF4在日本晴穗发育过程中呈下降趋势,而在307R中呈上升趋势。OsmiR396c在日本睛穗发育过程中的表达模式刚好与OsGRF4互补,暗示OsGRF4的功能可能受OsmiR396c调控。4、利用5'-RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技术,确定了OsmiR396c在日本晴幼穗中OsGRF4的剪切位点。在大粒材料307R中,OsmiR396c在该位点剪切效率只有正常材料的1/10左右。用不同背景的大粒基因近等基因系与一些不育系杂交,其F1代中存在OsGRF4正常与突变两种mRNA,通过对不同杂交组合F1代幼穗cDNA进行测序及峰图分析发现,正常OsGRF4 mRNA较大粒突变型mRNA出现了强烈的下调。该结果显示OsGRF4是OsmiR396的直接靶基因；OsGRF4与OsmiR396c结合位点两个碱基的突变降低了OsmiR396c的剪切效率,致使OsmiR396c对OsGRF4调控作用严重减弱,从而导致307R的大粒表型。5、对OsmiR396c过表达发现,阳性植株籽粒粒长和千粒重均极显著低于对照；细胞学观察发现,过表达阳性植株外稃表皮细胞明显小于对照。在不改变编码氨基酸序列的条件下,通过定点突变OsGRF4的cDNA序列构建2个mOsGRF4过表达载体。转基因结果显示过表达抗OsmiR396c剪切的mOsGRF4阳性植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著高于对照；细胞学观察发现,过表达阳性植株外稃表皮细胞明显大于对照。上述结果表明OsmiR396c可以通过对OsGRF4的直接负调控影响水稻粒型粒重,而去除或抑制这一调控过程可以提高水稻粒重。6、表达模式显示OsGIF1是一个组成型表达的基因,但其表达主要集中在茎和穗中。实验表明OsGIF1也定位于细胞核。利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证了OsGRF4和OsGIF1能发生直接相互作用。7、以2x35S为启动子,对OsGIF1进行过量表达。结果显示,过表达阳性植株籽粒粒长、粒宽及千粒重均极显著高于对照；细胞学观察发现,过表达阳性植株外稃表皮细胞明显大于对照。8、将近等基因系NIL-527R、NIL-MH63及对应亲本527R、MH63分别与不育系640A、106A进行杂交配制杂种F1。产量性状调查发现所有近等基因系组配后代株系的籽粒粒长、粒宽、千粒重和穗长极显著增加；其穗粒数和分蘖数无明显变化；所有近等基因系组配杂交稻单.株产量和单.位面积产量均显著增加,在不同亲本杂交后代中GLW2的增产潜力有差异,其增产幅度在13.74%-28.00%之间。9、根据上述实验,我们明确了OsGRF4是控制水稻粒型粒重的关键基因,在该基因的上游,OsmiR396c可以对其进行直接调控,而在下游,OsGRF4通过与具有多效性的OsGIF1基因直接互作来调控水稻粒型粒重,我们的结果建立了一个新的水稻粒型粒重的调控途径,即OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1的调控通路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S511

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