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TALEN和CRISPR技术在弓形虫致病机制研究中的应用

发布时间:2018-02-26 10:58

  本文关键词: Toxoplasma gondii TALEN CRISPR-Cas9 基因敲除 DNA疫苗 表达调控 出处:《华中农业大学》2016年博士论文 论文类型:学位论文


【摘要】:随着分子生物学技术的发展,人们对于基因的研究越来越透彻,基于基因的遗传改造技术也取得了飞速的发展。从ZFN到TALEN再到后来的CRISPR技术,短短八年时间,DNA靶向技术便经历了几次大的变革。由此也引发了以弓形虫为模式生物的顶复门寄生虫基因研究的技术突破。弓形虫是一种专性胞内寄生的原虫,可引起严重的人畜共患寄生虫病,给人类的生育健康和畜牧业的发展带来严重的危害。尽管关于弓形虫的基础研究已经取得了一定的成果,但在致病机制等方面仍知之甚少。这些新兴的遗传操作技术为此带来了突破的机会。本研究首先应用TALEN技术针对入侵的关键因子RON2进行移码突变,随后以DNA疫苗的形式对其各功能区进行免疫保护性验证;然后利用CRISPR-Cas9系统比较分析GRA7,ROP17,ROP18在本地分离株(T.g HB1)的毒力作用;构建了调控弓形虫基因转录的CRISPR-d Cas9抑制表达系统。1.TALEN技术介导的RON2的功能失活及RON2各功能域的免疫保护力验证根据RON2基因序列设计DNA靶点识别域,并构建相应的TALEN质粒;转染后根据RFP和GFP双荧光信号对虫体进行筛选验证,以PCR和测序的方法鉴定靶点结合域的序列突变。结果显示TALEN质粒成功诱导了RON2的移码突变,但由于RON2的功能缺失导致虫体入侵受阻,未分离到单克隆虫株。对RON2基因功能域进行分析,分别构建了三个pc DNA3.1-RON2(1/2/3)真核表达质粒,以100μg/只小鼠的剂量分别于0 d,14 d,28 d,42 d进行免疫。结果显示,RON2-1/2/3均刺激小鼠产生高水平的IFN-γ,但仅有RON2-3免疫组对小鼠有16.7%的免疫保护力。结果证实,RON2的胞外结构域可作为疫苗候选分子用于弓形虫疫苗的研究。2.CRISPR-Cas9系统介导的HB1弓形虫毒力相关因子的敲除首先,分别构建识别GRA7,ROP17,ROP18的CRISPR-Cas9-sg RNA质粒和用于同源重组修复的质粒(含GFP、DHFR*或CAT筛选标记);转染后的虫体经诊断PCR、Western-blot等鉴定最终获得△GRA7、△ROP17、△ROP18、△GRA7△ROP17、△GRA7△ROP18五个敲除虫株;通过空斑实验和小鼠攻虫实验验证敲除虫株的生物学特性。最终空斑结果表明五个突变株在体外培养过程中与野生型没有生长速度上的明显差异;攻虫结果显示△GRA7、△ROP17、△ROP18表现出不同程度的毒力下降,△GRA7△ROP17、△GRA7△ROP18表现出与△ROP17、△ROP18相似的毒力下降。结果表明GRA7,ROP17和ROP18等毒力因子在HB1株中发挥重要的毒力作用,与RH株致病模式存在差异。3.基于CRISPR-d Cas9系统对弓形虫SAG1启动子的抑制调控利用CRISPR-Cas9系统以SAG1P::RFP-SAG13’替代UPRT构建一株稳定表达RFP的弓形虫虫株;通过缺失切割活性的d Cas9和转录调节因子(KRAB)来构建CRISPR-d Cas9抑制系统;构建多个识别SAG1启动子的CRISPR-d Cas9质粒进行转录调控试验,通过荧光镜检的方法对SAG1的转录活性进行评价。结果显示,sg RNA结合在SAG1启动子-316至-297 bp处,p CRISPR-d Cas9-KRAB-sg SAG1的结合可实现对弓形虫内源基因SAG1和外源基因RFP的显著抑制。本研究通过TALEN技术诱导了RON2的移码突变,证实了RON2不可替代,并通过DNA疫苗实验验证了RON2作为疫苗候选分子的可能;利用CRISPR-Cas9系统验证了GRA7,ROP17,ROP18在HB1弓形虫中的毒力作用;构建了适用于弓形虫基因表达调控的转录抑制工具——CRISPR-d Cas9系统。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:华中农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S855.9

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本文编号:1537727

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