马铃薯纺锤块茎类病毒的qRT-PCR检测及其遗传进化分析

发布时间：2018-02-28 04:27

  本文关键词： 马铃薯 类病毒 q RT-PCR 多态性分析 系统发育分析 生物学检测　出处：《东北农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato spindle tuber viroid,PSTVd)是影响中国马铃薯生产的重要病原,一般可引起马铃薯植株矮化,叶片皱缩,块茎变小、畸形,产量下降等。该病害可以通过机械、无性繁殖以及实生种子等多种途径传播。目前,中国有很多马铃薯育种材料(包括种质资源和育成的品系等)已经感染了PSTVd,而PSTVd又很难通过茎尖组织培养脱除,且可以通过种子传递给下一代,因此,PSTVd已经给中国马铃薯育种工作带来了极大的困扰,更给马铃薯育种工作埋下了巨大的隐患。目前,防治的主要方法是生产健康(无马铃薯纺锤块茎类病毒)的脱毒马铃薯种薯。在马铃薯种薯的生产过程中,对脱毒马铃薯种薯/苗进行田间、库房和实验室检测是种薯/苗质量控制的最基本、最关键和最重要的手段。目前,中国在PSTVd研究方面存在以下几方面问题:(1)PSTVd检测技术体系尚不完善;(2)中国的马铃薯纺锤块茎类病毒发生、系统发育情况及致病力尚不十分清楚;(3)不同马铃薯品种感染PSTVd的症状复杂、不明确等。针对以上问题,开展了系列研究,并取得了以下结果:(1)建立了PSTVd的qRT-PCR检测体系:设计了3组引物并从中筛选出最适引物对PSTV-234F和PSTV-356R。利用这对引物,结合设计的Taqman探针(PSTV-251T),通过优化反应条件,建立了PSTVd的q RT-PCR检测体系。该检测体系不仅具有很高的检测灵敏度,检测极限为31.1拷贝/μL(101.17 ag/μL),而且具有非常好的稳定性。这一体系已经被成功地应用到马铃薯样品的检测。该体系的建立不仅丰富了PSTVd的检测手段,而且能够进一步提高PSTVd检测的准确性。(2)PSTVd发生情况调查及中国分离物的序列分析:2009年~2014年间,对1000余份马铃薯种薯/苗样本进行了PSTVd调查,结果显示,在此期间,PSTVd每年都有发生,平均感染率为6.5%。本研究测定了来自黑龙江、吉林、辽宁、山东、内蒙古和陕西共6个省份的71个不同样本中的PSTVd序列。序列分析发现,每个分离物中至少含有一种主流序列,共获得74条主流序列。这些主流序列包含42种不同的序列变体(Accession numbers KR611334~KR611376)。BLAST结果表明,在42种不同的序列变体中,有12种与Gen Bank中登录的PSTVd的序列相同,而其余30种则是新的PSTVd变体,目前仅从中国分离得到。这些序列的获得为理解PSTVd的传入、流行、遗传变异等问题奠定了基础。首先,分析了中国流行的PSTVd序列变体,发现在中国流行的变体与其他国家的PSTVd分离物具有很高的序列相似性或者完全一致;其次,在中国,除弱毒株系外,从中国还分离到3种PSTVd中间株系,表明PSTVd中国分离物具有不同的致病性;此外,对获得的42种不同的PSTVd序列变体与Gen Bank中登录的165条自然条件下分离出PSTVd的序列进行了系统发育分析。整体上,PSTVd可以被分成两组(第I组和第II组),第II组能够被进一步分为三个亚组(亚组A~C)。所有的中国PSTVd分离物均被包含在第II组,而且总是与俄罗斯的分离物聚在一起,这表明中国和俄罗斯的PSTVd可能具有相同的起源。最后,对42种不同的中国PSTVd变体的突变位点进行了系统分析,发现绝大部分的变体通过一个位点的突变就可以联系到一起,这表明突变可能是中国PSTVd分离物进化的主要动力。(3)PSTVd中国分离物的致病性验证及不同马铃薯品种感染PSTVd的症状表现。将PSTVd中国分离物接种到4个马铃薯主栽品种(荷兰15,夏坡地,克新18和尤金)后,观察症状表现,调查株高、叶片、单株产量、块茎外观等指标。观察发现4个品种均不同程度地表现出植株矮化、叶片皱缩、块茎变小、产量降低和块茎畸形等症状。说明这4个马铃薯品种对PSTVd的侵染均是敏感的。数据统计结果表明,与对照相比,感病植株的平均株高降低30.1%,平均单株产量降低40.2%。这些结果表明:虽然PSTVd中国分离物可能是弱毒株系,但其对马铃薯生产仍然具有严重的影响。此外,不同品种感染PSTVd后有不同的症状表现,在进行田间和库房检测时应注意品种之间的差异。总之,本研究建立了PSTVd q RT-PCR检测技术体系,提高了PSTVd的检测灵敏度和准确性;通过多年的调查与分析掌握了目前PSTVd在中国北方的发生情况;通过系统发育分析对中国PSTVd分离物进行了系统研究,基本掌握了PSTVd中国分离物的分子进化关系及系统发育情况;通过PSTVd接种马铃薯鉴定,推测了PSTVd中国分离物的致病力情况,并了解了不同马铃薯品种感染PSTVd后植株和块茎的表现,为PSTVd田间和库房检测提供了技术指导。以上工作为PSTVd的防控、风险评估等工作奠定了基础,同时为解决PSTVd对马铃薯育种工作造成的影响提供了防控的技术手段。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S435.32

【参考文献】

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本文编号：1545758