裂核杏内果皮的形态特征及形成机理研究

发布时间：2018-03-02 07:30

本文关键词： 杏候选基因比较转录组内果皮发育及木质化苯丙烷途径　出处：《沈阳农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：杏(Prunus.armeniaca L.)是蔷薇科(Rosaceae)家族中典型的核果类果树,其内果皮的高度木质化是果实成熟的重要标志之一。中国具有丰富的杏种质资源,其中许多品种具有很高的育种价值。裂核杏('Liehe',LE apricot)原产于辽宁省凌源市,是非常稀有的栽培品种,其内果皮薄、组织较软且伴有开裂现象,部分种子外露。裂核杏内果皮的厚度仅为锦西红杏(内果皮发育正常)的60.39%。本研究以裂核杏为主要试材,利用物候期相同、起源地相近的锦西红杏为对照,研究了杏果实发育四个物候期的划分,观察了杏内果皮早期发育及木质素沉积过程,借助转录组测序挖掘与杏内果皮发育及木质素沉积相关的差异基因,分析了差异基因在果实发育期间的表达水平,克隆了重要差异基因CAD、NST1,并通过不同品种仁用杏加以验证,以期探讨裂核杏内果皮发育的内在机制。主要研究内容如下:1.利用Pearl-Reed logistic模型拟合裂核杏与锦西红杏的生长曲线并求出一阶导数,结合ACO1和PEPCK基因的表达水平将两种杏果实发育划分为四个相同的时期(S1-S4)。两种杏内果皮发育进程相似,木质素沉积过程需要25 d左右。花后15 d,裂核杏内果皮开始出现开裂。通过Klason法测定内果皮中木质素的含量、差重法测定内果皮中纤维素和半纤维素的含量,结果显示:内果皮的厚度与木质素含量呈极显著正相关,且裂核杏的内果皮厚度显著薄于锦西红杏。花后42 d,裂核杏内果皮的脆性、硬度、内聚性与粘着性分别是锦西红杏的1.13、0.46、0.73与5.27倍,差异显著。2.对花后15 d和花后21 d裂核杏与锦西红杏果实进行高通量测序,共获得40.15 Gb原始数据,Denovo组装后一共获得63,170条基因,其中25,123条基因被NCBI蛋白数据库注释。表达模式分析一共获得5385条差异基因。富集分析发现,苯丙氨酸代谢、苯丙烷生物合成途径影响显著,且其中包含共34个与苯丙烷途径相关的差异基因。通过差异基因的挖掘和实时荧光定量的验证发现,花后15d,C4D(c10104.c0)在裂核杏果实中的表达比锦西红杏低4.56倍;花后21 d表达量低了 5.52倍,差异非常显著。裂核杏果实中C4D表达量与内果皮厚度之间存在显著相关(5%)。3.利用同源克隆法分别从裂核杏与锦西红杏中获得CAD与NST1序列。裂核杏与锦西红杏NST1两条片段的长度均为1187 bp,各编码395个氨基酸,存在2个差异氨基酸。裂核杏与锦西红杏差异氨基酸位点位于motif 3和motif 6。裂核杏这两个氨基酸(A、L)出现概率非常小。CAD两条片段长度均为1092 bp,各编码363个氨基酸,存在5个差异氨基酸,其中裂核杏位于122 aa及127 aa的卷曲之间存在横跨3个aa的β-折叠,而锦西红杏的β-折叠横跨2个aa。裂核杏位于294 aa的αα-螺旋之后存在横跨5个aa的β-折叠,而锦西红杏β-折叠横跨3个aa。4.利用酶联免疫法测定了果实S1、S2发育期间肉桂醇脱氢酶活性的动态变化,在木质素大量沉积的S2时期(30～49 d),锦西红杏的CAD活性持续上升,裂核杏CAD活性先小幅度升高后不断降低,裂核杏与锦西红杏CAD的表达量与其内果皮厚度分别呈5%和1%水平的显著相关性,且裂核杏肉桂醇脱氢酶活性与内果皮厚度呈1%水平极显著相关性。裂核杏与锦西红杏不同发育时期的果实中CAD及NST1的表达水平存在差异。锦西红杏果实中CAD的表达均显著高于裂核杏。裂核杏果实中NST1的表达量除了花后33 d(S2时期)外,其余时期均显著低于锦西红杏。5.利用试剂盒测定裂核杏与锦西红杏果实漆酶(LAC)、过氧化物酶(POX)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,同时分析LAC4、PER2、PAL表达水平。S1期间,LAC4、PER72的表达水平及LAC、POX活性一般表现为裂核杏低于锦西红杏,PAL的表达水平及PAL活性为裂核杏高于锦西红杏。裂核杏中内果皮木质素含量的变化与LAC活性显著正相关(5%),与POX的活性呈显著负相关(5%);锦西红杏中内果皮木质素含量的变化与LAC活性也呈显著正相关(5%)。6.不同品种仁用杏之间内果皮的厚度差异非常显著,内果皮相关10个因素测定数据用SPSS进行主成分分析,第1主成分贡献率最高,达到38.69%,主要以内果皮厚度、内果皮干重、肉桂醇脱氢酶(CAD)活性及漆酶(LAC)活性影响为主。前5个主成分积累贡献率达94.78%。主成分得分综合排名为(从高到底):龙王帽、锦西红杏、裂核杏后代、白玉扁、一窝蜂、围选1号、裂核杏、优一。内果皮从厚到薄的排序为白玉扁、锦西红杏、龙王帽、一窝蜂、裂核杏后代、裂核杏、围选1号、裂核杏、优一。主成分排序与实际测量值之间排序的规律非常相似,能明显区分出内果皮厚、薄的杏品种。综合以上结果研究发现,裂核杏内果皮与锦西红杏存在巨大差异的主要原因是裂核杏内果皮质地过脆,核肉黏连紧密,木质素沉积较少所导致。而CAD及NST1可能与该差异有重要的联系。
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【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S662.2

【参考文献】