Tet1对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新与增殖的表观修饰调控

发布时间：2018-03-02 22:19

  本文选题：Tet1(Ten-eleven　切入点：translocation　出处：《西北农林科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：奶山羊是我国重要的经济动物,保持和优良奶山羊品种,实现快速繁殖是现代农业的目标,奶山羊雄性生殖干细胞(male germline stem cell,mGSCs)自我更新的维持和发育分化的相关基础性研究也逐步深入,家畜mGSCs体外培养体系不稳定、重编程效率低等问题都亟待解决。研究表明表观修饰在精子发生过程中发挥着重要的调控作用。特定位点的DNA甲基化动态变化是维持正常精子发生的关键。Tet1(Ten-eleven translocation 1)作为主要的去甲基化酶,参与精子发生的表观修饰调控进程。因此,开展mGSCs的表观遗传学研究,不仅有助于探究成体干细胞体外培养技术的优化体系,推进mGSCs自我更新与分化机理的探索;而且在畜牧业生产上对提高优良种畜的精子质量,减少疾病发生,促进家畜大动物优良品种的遗传与繁育有重要意义。本研究以奶山羊为研究对象,对Tet1及产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)进行表达谱和定位分析,同时探究了奶山羊精子发生过程中的dimethyl histone H3 lysine 9(H3K9me2)和tri-methyl H3 lysine 9(H3K9me3)在不同年龄阶段睾丸组织的甲基化模式;利用Tet1过表达的方法修饰mGSCs并筛选阳性单细胞克隆,观察细胞形态学、基因表达差异和DNA甲基化、组蛋白甲基化的变化;通过自发分化与体内移植对Tet1过表达的mGSCs进行功能验证,并分析Tet1与蛋白互作的调控机理。结果发现:(1)Tet1在奶山羊睾丸组织中表达水平较低,且主要分布于曲细精管基底膜的精原细胞中;对其产物5hmC在不同年龄阶段奶山羊睾丸组织中的含量与定位进行检测,表明5hmC随年龄增加而降低,且在mGSCs与支持细胞都有分布;奶山羊精子发生过程中的组蛋白H3K9me2在不同年龄阶段睾丸组织呈现先升后降的模式,在青春期达到峰值;而H3K9me2含量则是随年龄增长持续缓慢升高。成年睾丸组织中dimethyl histone H3 lysine 4(H3K4me2)定位于减数分裂后期的圆形精细胞,tri-methyl H3 lysine 27(H3K27me3)在mGSCs中呈现特殊的核周定位;在体外培养的mGSCs中,Tet1在维持自我更新的mGSCs中表达,在分化状态下表达降低;5hmC与其表现同样的趋势;同时对体外培养的mGSCs中H3K9me2和H3K9me3进行检测,发现维持自我更新的mGSCs克隆和趋于分化的克隆及未形成克隆的细胞相比含量含量较低。(2)生物信息学分析不同物种间Tet1基因的遗传同源性和保守结构域,通过对Tet1基因共有的发挥功能关键的识别结构域和催化结构域进行分析,确定小鼠Tet1(mTet1)在山羊源细胞中发挥作用;筛选Dox诱导表达mTet1的阳性单细胞克隆,在基因、mRNA和蛋白水平进行鉴定后观察细胞形态,发现mTet1阳性细胞细胞核变大,且5hmC含量增加;通过阶梯浓度培养确定0.50μg/mL的Dox浓度为最佳的诱导培养浓度;QRT-PCR、免疫荧光染色和western blot检测发现mTet1阳性细胞中Gfra1、PCNA、CCND1、Ki67、ETV5等增殖和生殖特异性标志基因表达上调,分化特异性基因REC8表达下调;Tet1过表达的奶山羊mGSCs的阳性细胞,组蛋白甲基化相关的H3K9me2和H3K9me3含量有所下降,且H3K9me3由细胞核内颗粒状分布转变为均匀分布;H3K27me3含量显著降低,由细胞核内均匀分布转变为向核周分布。(3)构建过表达Tet1慢病毒载体,对筛选出的稳定过表达Tet1的奶山羊mGSCs阳性克隆(mGSC-pCDH-mTet1)细胞进行QRT-PCR检测,筛选出既能维持mGSCs自我更新又促进细胞增殖的克隆;制备mGSC-pCDH-mTet1细胞和mGSC-pCDH细胞的类胚体(EBs),自发分化试验检测体外分化能力,发现mGSC-pCDH-mTet1细胞自发分化后的细胞三胚层分化的速度较慢,说明mTet1具有维持自我更新、抑制分化的功能;对生殖缺陷小鼠模型进行mGSC-pCDH-mTet1细胞和mGSC-pCDH细胞的曲细精管移植,4周采集睾丸,制成石蜡切片,并进行PGP9.5、VASA、PCNA、Ki67等生殖与增殖相关特性标记的检测,证实mGSC-pCDH-mTet1细胞在生殖缺陷小鼠的曲细精管内不仅维持mGSCs的特性,还有显著的增殖能力。(4)对mTet1在mGSCs中发挥作用的方式进行分析,确认mTet1通过上调组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达,下调H3K27me3的含量并发生从核内向核周分布的定位变化,此过程伴有MEK-ERK信号通路的抑制;mTet1通过与Hdac1形成蛋白复合体,共同调节组蛋白乙酰化状态,进行mGSCs的表观修饰调控;mTet1与PCNA形成蛋白复合体,通过mTet1过表达来促进mGSCs的增殖。综上所述,本研究从体内和体外分析了Tet1在奶山羊曲细精管和细胞中的分布;同时研究Tet1修饰引起的形态变化和基因调控机理。这不仅为精子发生过程中Tet1表达调控进一步的研究提供思路,为更深入探究表观修饰调控在奶山羊mGSCs的发育与分化作用奠定了基础。
[Abstract]:Dairy goat is an important economic animal in China, and maintain excellent dairy goat breeds, fast breeding is the modern agriculture, dairy goat male germline stem cells (male germline stem cell, mGSCs) on the self-renewal and differentiation of the relevant basic also gradually thorough, livestock mGSCs in vitro culture system is not stable reprogramming, low efficiency problems should be solved. The research showed that epigenetic modifications in spermatogenesis play an important role. Methylation sites of the DNA dynamic change is key to maintaining.Tet1 normal spermatogenesis (Ten-eleven translocation 1) as the main enzyme to methylation, participate in spermatogenesis of epigenetic modification the regulation process. Therefore, to carry out mGSCs epigenetic research not only helps to explore the training system optimization technology of adult stem cells in vitro, promote mGSCs self-renewal and differentiation mechanism Exploration; and in animal husbandry to improve sperm quality of breeding livestock, reduce disease, promote important genetic and breeding of fine varieties of livestock animal. In this study, the dairy goat as the research object, the Tet1 and 5- product hydroxymethylcytosine (5hmC) spectral analysis and positioning for expression, at the same time to explore the dairy goat during spermatogenesis of dimethyl histone H3 lysine 9 (H3K9me2) and tri-methyl H3 lysine 9 (H3K9me3) methylation patterns in the testis of different age stages; using Tet1 over expression method of modified mGSCs and screening of positive clones to observe the cell morphology, gene expression and DNA methylation changes. Histone methylation; through spontaneous differentiation and in vivo transplantation on expression of Tet1 mGSCs functional verification, and analyze the regulation mechanism of Tet1 and protein interaction. Results showed that: (1) Tet1 in dairy goats Testis tissue expression level is low, and is mainly distributed in the basal membrane of the seminiferous tubules of spermatogonial cells; to detect the content of the product and location of 5hmC in the testis of different age stages in dairy goats, showed that 5hmC reduced with the increase of age, and are distributed in mGSCs and Sertoli cells; goat in the process of spermatogenesis of histone H3K9me2 first increased and then decreased in testis of different age stages, and reached the peak in adolescence; while the content of H3K9me2 is continuously increased slowly with the growth of age. Adult testis tissue dimethyl histone H3 lysine 4 (H3K4me2) located in the postmeiotic round spermatid, tri-methyl H3 lysine 27 (H3K27me3) showed a perinuclear localization of particular in mGSCs; in mGSCs cultured in vitro. Tet1 expression in maintaining the self-renewal of mGSCs, reduce the expression of differentiation in 5hmC and its performance of the same state; The trend; at the same time. H3K9me2 and H3K9me3 mGSCs in vitro, found to maintain mGSCs self-renewal and cloning cloning tend to differentiation and did not form the cloned cells compared to content was lower. (2) analysis of Tet1 gene among species genetic homology and conserved domain of biological information analysis based on the Tet1 gene common play domain and the catalytic domain of the structure and function of the key identification, determination of mouse Tet1 (mTet1) play a role in goat derived cells; screening Dox positive single cell cloning, expression of mTet1 gene in induction, cell morphology was observed and identified by mRNA and protein levels, found that mTet1 positive nuclei become large increased, and the content of 5hmC; through the ladder concentration determine the Dox concentration of 0.50 g/mL for induction and the optimum concentration; QRT-PCR, immunofluorescence and Western blot detection found mTet1 positive cells The cell in Gfra1, PCNA, CCND1, Ki67, ETV5, proliferation and reproductive specific marker expression of differentiation specific gene REC8 expression; Tet1 positive cells expressed goat mGSCs, histone methylation of H3K9me2 and H3K9me3 content decreased, and H3K9me3 from the nucleus into a uniform distribution of particles distribution; H3K27me3 content decreased significantly, the nucleus uniform distribution into the nucleus. (3) construct Tet1 lentiviral expression vector, screened over expression of goat mGSCs positive clone Tet1 (mGSC-pCDH-mTet1) cells were detected by QRT-PCR. The selected mGSCs can maintain the self-renewal and promote cell cloning proliferation; preparation of mGSC-pCDH-mTet1 cells and mGSC-pCDH cells of the embryoid body (EBs), spontaneous differentiation differentiation assay in vitro, found that mGSC-pCDH-mTet1 cells spontaneously differentiated cells after three embryos Layer differentiation is slow, indicating that mTet1 has self-renewal and inhibits differentiation of seminiferous function; mGSC-pCDH-mTet1 cells and mGSC-pCDH cells of reproductive deficient mice transferred 4 weeks collecting testis, made of paraffin, and PGP9.5, VASA, PCNA, Ki67 detection and proliferation related markers reproductive characteristics. The characteristics showed that mGSC-pCDH-mTet1 cells in the seminiferous tube reproductive deficient mice not only maintain mGSCs, there is a significant proliferation. (4) of mTet1 play a role in mGSCs mode analysis, confirmed the expression of mTet1 through upregulation of histone demethylase JMJD3, downregulation of H3K27me3 content and changed from location within weeks of the nuclear nuclear distribution, inhibition of this process with the MEK-ERK signaling pathway by mTet1; and the formation of Hdac1 protein complex, CO regulation of histone acetylation modification, in the mGSCs table view The regulation of mTet1; and the formation of PCNA protein complex, expressed by mTet1 to promote the proliferation of mGSCs. In conclusion, this study analyzed the distribution of Tet1 in goat seminiferous tubules and cells in the in vivo and in vitro; morphological changes and gene regulation of Tet1 modified by the machine at the same time. This is not only in the process of spermatogenesis the expression of Tet1 to provide ideas for further research to further explore the regulation, epigenetic regulation in the development and differentiation of goat mGSCs laid the foundation.

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827

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本文编号：1558354