牦牛全基因组CNV及高原适应性候选基因（HO1）的研究

发布时间：2016-11-02 10:59

  本文关键词：牦牛全基因组CNV及高原适应性候选基因（HO1）的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《甘肃农业大学》 2015年

牦牛全基因组CNV及高原适应性候选基因（HO1）的研究

张全伟  

【摘要】：牦牛(Bos grunniens)具有重大的的经济价值和科学研究价值。近年来的研究表明拷贝数变异(Copy number variant,CNV)与复杂的疾病特征和多数表型相关,因此CNV逐渐被认为是重要的和丰富的遗传变异和表型多样性的来源之一。但迄今为止,尚未有相关报道解析牦牛基因组CNV的结构及其作用,对牦牛CNV检测亦未见相关的SNP芯片或者CGH芯片。因此,一种被称为“跨种分析”的方法,即采用同源性较高的物种的芯片杂交检测,可用于解决此问题,现已被用于多种哺乳动物相关研究。如人类芯片被用来检测相关的同源物种,如黑猩猩、猩猩和其他灵长类动物等。本研究,采用含有777962个探针、平均间距为3.43 kb的牛Bovine HD基因分型单核苷酸多态性芯片检测天祝白牦牛和青海牦牛的CNV,本研究以秦川牛(Bos taurus)作为对照,来验证Bovine HD芯片筛选鉴定牦牛CNVR的准确性和可靠性。而秦川牛作为一种肉乳兼用性中国地方牛种也具有重要的经济价值、畜牧价值和科研价值,但迄今为止未见关于秦川牛CNV的研究报道。对照组秦川牛(n=6)基因组中发现367个Unique CNV,其平均大小为35.5kb。通过重叠CNV,形成CNVRs(Copy number variant regions),最终发现有365个CNVRs,其中包括131个Loss,234个Gain,平均每个样本中含有60.8个CNVRs。CNVRs总片段大小为13.13 Mb,约覆盖牛基因组0.4%的序列,其平均大小为35.07 kb,中位值为18.56 kb。根据Bovine HD基因分型筛选获得秦川牛的CNVRs构建其CNVRs染色体遗传图谱。基因功能分析结果表明:筛选获得CNVRs的大部分候选基因与离子或分子功能(如嗅觉受体活性、离子通道活性、特异性酶底物通道活性和被动运输通路活性等)、生物学进程(G蛋白偶联受体信号通路和细胞表面离子表面受体信号转导)及传导通路(嗅觉转导)等相关。将本研究获得的秦川牛CNVRs与已报道牛CNVRs文献比对分析,CNVRs交叠重合率分别为18.3%,5.6%,2.1%,8.7%,42.7%,0.7%,13.9%,0.9%,3.7%和2.1%。实验组不同品种牦牛(天祝白牦牛n=100,青海牦牛n=100)内发现943个CNVs,其平均大小为120.76 kb。重叠CNVs形成CNVRs后发现857个CNVRs,包括558个Loss,297个Gain和2个Both。其总片段长度为127.99 Mb,约覆盖牦牛基因组4.79%的碱基。片段长度从1.708 kb到8.82 Mb不等,其平均长度为149.43 kb,中位值为24.8 kb。根据Bovine HD基因分型筛选获得的不同品种牦牛的CNVRs成功构建其CNVRs染色体遗传图谱。基因功能分析结果揭示:筛选获得CNVRs的与嗅觉受体活性、G蛋白偶联受体信号通路、细胞表面受体信号转导、跨膜运输和嗅觉转导离子分子功能相关。从857个CNVRs中筛选不同类型(Loss,Gain和Both)、不同频率的17个CNVRs进一步进行荧光定量PCR验证,其中13个CNVRs确认真实存在于牦牛基因组。根据基因芯片筛选结果可知,血红素加氧酶1(HO1)作为牦牛高原适应性的候选之一,对其进行克隆研究。本研究中,通过反转录PCR(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)和c DNA末端扩增法(rapid-amplification of c DNA ends,RACE-PCR)从牦牛肝脏中获得全长为1600 bp的HO1基因序列,该序列包含867 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),预测编码289个氨基酸(amino acids,AA),将序列提交至NCBI并获得其登录号为KF 888632。通过生物学软件分析其二级结构,结果表明其含有139个氨基酸构成10个α螺旋和1个β折叠,150个氨基酸构成无规卷曲。预测获得牦牛HO1蛋白3D结构与人和大鼠HO1蛋白3D结构比对分析表明:单链具有相似的结构,而双链分布于不同的空间;并预测HO1蛋白的血红素亚铁离子、Fe2+气体分子结合位点。所有结构均表明三者之间,单链结构相似,空间结构彼此不同。荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q PCR)结果显示牦牛肺组织HO1基因表达量最高;免疫组织化学染色和免疫印迹结构均显示肺组织HO1蛋白表达具有明显的优势。结果揭示HO1的功能可能与呼吸系统有密切的关系。上述结果为进一步对牦牛品种遗传改良提供依据和资源。对今后高原物种对高原地区的适应性和其相关生物学的研究奠定基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823.85
【目录】：

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